Nûçe

Spas ji bo serdana Nature.com.Guhertoya geroka ku hûn bikar tînin piştgirîya CSS-ê sînordar e.Ji bo ezmûna çêtirîn, em pêşniyar dikin ku hûn gerokek nûvekirî bikar bînin (an jî Moda Lihevhatinê ya di Internet Explorer de neçalak bikin).Di vê navberê de, ji bo misogerkirina piştgirîya domdar, em ê malperê bê şêwaz û JavaScript pêşkêş bikin.
Rêbazên nîşankirina nêzîkbûna enzîmatîk ên ku li ser bingeha esterên aktîfkirî an radîkalên fenoksî ne, bi berfirehî têne bikar anîn da ku nexşeya proteomên binehucreyî û danûstendinên proteîn ên di hucreyên zindî de.Lêbelê, esterên aktîfkirî kêmtir reaktîf in, di encamê de tîrêjek nîşankirinê ya berfireh çêdibe, û radîkalên fenoksî yên ku ji hêla dermankirina peroksîdê ve têne hilberandin dikarin bi rêyên redoxê re asteng bikin.Li vir em rêbazek fotoaktîvkirina girêdayê nîşankirina nêzikbûnê (PDPL) ku ji hêla genetîkî ve girêdide proteîna fotosensitizer miniSOG bi proteînek balkêş ve hatî pêşve xistin rapor dikin.Ji hêla ronahiya şîn ve hatî kişandin û ji hêla dema verastkirinê ve tê kontrol kirin, oksîjena yekalî tê hilberandin û dûv re etîketkirina bermahiyên histidine ji hêla sondaya anilînê ve ji hêla cîhê-demî ve tête çareser kirin.Em pêbaweriya wê ya bilind bi nexşeya proteome ya organel-taybet nîşan didin.Berhevokek alî-bi-alî ya PDPL bi TurboID re vegirtinek proteomîkî ya PDPL-ya taybetî û berfirehtir nîşan dide.Dûv re, me PDPL li hevaktîvatora transkrîpsiyona bi nexweşiyê BRD4 û E3 Parkin lîgaza ve girêdayî kir û danûstendinên berê nenas dîtin.Bi ceribandina zêdederbirînê, du substratên nenas, Ssu72 û SNW1, ji bo Parkin, ku hilweşîna wî bi riya ubiquitination-proteasome ve tê nas kirin, hatin nas kirin.
Taybetmendiya rast a torên proteîn di binê gelek pêvajoyên hucreyî yên bingehîn de ye.Ji ber vê yekê, nexşeya cîhê-demkî ya pir rast a danûstendinên proteînan dê bingehek molekulî ji bo deşîfrekirina rêyên biyolojîkî, patholojiya nexweşiyê, û têkbirina van têkiliyan ji bo mebestên dermankirinê peyda bike.Ji bo vê armancê, rêbazên ku karibin têkiliyên demkî yên di şaneyên zindî an tevnhev de tespît bikin, pir tê xwestin.Spectrometrya Komkujî ya Paqijkirina Affinity (AP-MS) di dîrokê de ji bo naskirina hevkarên girêdana proteînên balkêş (POI) tê bikar anîn.Bi pêşveçûna rêbazên proteomîk ên mîqdar, Bioplex3.0 hate afirandin, databasa herî mezin a torên proteîn ên li ser bingeha AP-MS.Her çend AP-MS pir bi hêz e, gavên lîz û helandinê yên hucreyê di herikîna xebatê de ber bi danûstendinên girêdanê yên qels û demkî ve girêdayî ne û hunerên paş-lîzê yên wekî cotên danûstendina xapînok ên ku berî lîzkirinê kêmasiya dabeşkirinê ne destnîşan dikin.
Ji bo çareserkirina van pirsgirêkan, asîdên amînî yên nexwezayî (UAA) yên bi komên xaçgirêdanê û platformên nîşankirina nêzê enzîmatîk (PL) (mînak APEX û BioID)5 hatine pêşve xistin.Her çend rêbaza UAA di gelek senaryoyan de bi serfirazî hatî sepandin û agahdariya li ser pêgirên proteîn ên rasterast peyda dike, xweşbînkirina cîhê têketina UAA hîn jî hewce ye.Ya girîngtir, ew rêbazek etîketkirina stokyometrîk e ku ji bervegera katalîtîk a bûyerên nîşankirinê tune ye.Berevajî vê, rêbazên PL-ê yên enzîmatîk, wek rêbaza BioID, biotin lîgaza endezyarkirî bi POI7 re dişewitîne, ku dûv re biotin çalak dike da ku navberek esterek biotinyl-AMP-a reaktîf pêk bîne.Enzîm bi vî rengî katalîze dike û "ewrê" biotînek aktîfkirî ya ku bermahiyên lîzînê yên nêzîk etîket dike vedike.Lêbelê, BioID ji 12 demjimêran zêdetir hewce dike ku nîşanek têr a nîşankirî bistîne, ku karanîna wê bi çareseriya demkî re asteng dike.Bi karanîna pêşkeftina rêvekirî ya li ser bingeha nîşana hevîrtirşkê, TurboID li ser bingeha BioID hate sêwirandin da ku bikêrtir be, di nav 10 hûrdeman de rê dide nîşankirina biotin a bikêrhatî, ku dihêle ku pêvajoyên dînamîkî bêtir werin lêkolîn kirin.Ji ber ku TurboID pir çalak e û astên biotînê yên endojen ji bo nîşankirina asta nizm bes in, dema ku bi lêzêdekirina biotinê exogenous etîketkirina pir pêşkeftî û demdirêj pêdivî ye ku nîşankirina paşîn dibe pirsgirêkek potansiyel.Wekî din, esterên aktîf kêm reaktîf in (t1/2 ~ 5 min), ku dikare bibe sedema tîrêjek mezin a nîşankirinê, nemaze piştî têrbûna proteînên cîran bi biotin 5. Di nêzîkatiyek din de, tevhevkirina genetîkî ya ascorbate peroxidase (ango biotin- fenol radîkal dike û destûrê dide nîşankirina proteînê di nav yek hûrdemê de 9,10. APEX bi berfirehî ji bo naskirina proteomên binehucreyî, kompleksên proteîna membranê, û kompleksên proteîna sînyala sîtosolîk tê bikar anîn11,12. Lêbelê, hewcedariya bi giraniya zêde ya peroksîdan dikare bandorê li proteînên redoks an rêyên ku bikeve pêvajoyên hucreyî.
Ji ber vê yekê, rêbazek nû ya ku bikaribe celebên tepeserkirina bi nîşankirî-radyusê reaktîftir bi rastbûna mekan û demkî ya bilind bêyî ku rêyên hucreyî bi girîngî têk bibe, dê bibe pêvekek girîng ji rêbazên heyî re. Di nav cureyên reaktîf de, oksîjena yekalî ji ber temenê xwe yê kurt û tîrêjê belavbûna tixûbdar (t1/2 <0,6 μs di hucreyan de) bala me kişand. Di nav cureyên reaktîf de, oksîjena yekalî ji ber temenê xwe yê kurt û tîrêjê belavbûna tixûbdar (t1/2 <0,6 μs di hucreyan de) bala me kişand. Navnîşana aktîv a form наше внимание Привлек синглетный ji bo demajoya jiyanê û rêjeyên sînorkirî (t1/2 < 0,6 mx в клетках)13. Di nav formên çalak de, oksîjena yekalî ji ber temenê xwe yê kurt û tîrêjê belavbûna tixûbdar (t1/2 < 0,6 µs di hucreyan de) bala me kişand.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中摏 1/2 < 0,6 µs）而引起了我们的注意13 Navnîşana aktîvnыh form наше внимание привлекает синглетный ji bo ego korotkogo timeni жизни û rêjeyên sînorkirî (t1/2 < 0,6 mx в клетках). Di nav formên çalak de, oksîjena yekalî bala me dikişîne ji ber temenê xwe yê kurt û tîrêjê belavbûna tixûbdar (t1/2 <0,6 μs di hucreyan de).Hat ragihandin ku oksîjena yekalî bi rasthatinî methionine, tyrosine, histidine û trîptofanê oksid dike, ji bo girêdana bi lêkolînên amîn an tîolê re 14,15 polar dike16,17.Her çend oksîjena yekalî ji bo nîşankirina RNA-ya beşa binehucreyî hate bikar anîn, stratejiyên ji bo veguheztina nîşangirên nêzîkbûna POI-ya endojen nehatine vekolandin.Li vir, em platformek bi navê nîşankirina nêzîkbûna bi wêne-aktîvkirinê (PDPL) pêşkêş dikin, ku li wir em ronahiya şîn bikar tînin da ku POI-yên ku bi fotosensitîzerek miniSOG ve girêdayî ne ronî bikin û hilberîna oksîjenê ya yekalî derxînin da ku bermahiyên nêzîkê oksîd bike, li dûv re jî guheztinên amîn-hewadar ji bo oksidkirina sondajên kîmyewî di nav de. xaneyên zindî yên navîn..Me komek lêkolînên kîmyewî ceriband da ku taybetmendiya tagê zêde bikin û malperên guheztinê bi karanîna karûbarek proteomîk a vekirî nas kirin.Berhevokek alî-bi-alî ya PDPL bi TurboID re vegirtinek proteomîkî ya PDPL-ya taybetî û berfirehtir nîşan dide.Me ev nêzîkatî li nîşankerên organel-taybet ên proteoma binehucreyî û nasîna proteoma giştî ya hevkarên girêdanê yên ji bo proteîna birêkûpêk a epigenetîk BRD4-ya têkildar û nexweşiya Parkinson-ê ya E3 ligase Parkin, ku hem toreyek proteînê ya naskirî û hem jî nenas piştrast kir. danûstendinên..Kapasîteya PDPL ku substratên E3 di kompleksên proteîn ên mezin de nas bike, rewşek ku nasîna girêdanên nerasterast hewce dike destnîşan dike.Du substratên parkînê yên nenas ên ku ji hêla ubiquitination-proteasome ve têne navbeyn kirin li cîhê hatine pejirandin.
Terapiya fotodînamîk (PDT)19 û neçalakkirina lazerê ya bi alîkariya kromoforê (CALI)20, ku tê de tîrêjkirina ronahiyê bi fotosensitizatoran oksîjena yekalî çêdike, dikare proteînên armanc neçalak bike an jî bibe sedema mirina hucreyê.Ji ber ku oksîjena yekalî maddeyek pir reaktîf e ku bi dûrbûna belavbûna teorîkî ya bi qasî 70 nm e, oksîdasyona bi cîhûwarî ya li dora wênesazkerê dikare were kontrol kirin.Li ser bingeha vê têgehê, me biryar da ku em oksîjena yekalî bikar bînin da ku bigihîjin nîşankirina nêzîk a kompleksên proteîn ên di hucreyên zindî de.Me nêzîkatiyek kemoproteomîkî ya PDPL pêşxistiye ku çar fonksiyonan pêk bîne: (1) katalîzkirina nifşa oksîjena yekalî ya çalak a mîna nêzîkatiya enzîmatîk a PL;(2) li ser destpêkirina ronahiyê nîşankirina dem-çareserkirî peyda bikin;(3) bi guheztinê (4) Ji karanîna kofaktorên endojen (wek biotin) dûr bixin da ku paşxanê kêm bikin, an jî reagentên eksogenous ên pir xedar (wek peroksîdan) bikar bînin da ku şaneya hucreyê ji stresa jîngehê kêmtir bikin.
Fotosensitizator dikarin li ser du kategoriyan werin dabeş kirin, di nav de floroforên bi giraniya molekularî ya piçûk (mînak gul bengal, metîlen şîn)22 û proteînên piçûk ên bi genetîkî têne kod kirin (mînak miniSOG, KillerRed)23.Ji bo ku bigihîjin sêwiranek modular, me platforma PDPL-a nifşa yekem bi lê zêdekirina proteînên wênesazker (PS) li POI24,25 (Wêne 1a) pêşxist.Dema ku bi ronahiya şîn tê tîrêjkirin, oksîjena yekalî bermahiyên asîda amînî yên nukleofîlîk ên nêzik oksîde dike, di encamê de polarîtek umpolung ku elektrofîl e û dikare bêtir bi nukleofîlên proba amîn re reaksiyonê bike 16,17.Lêpirsîn bi destek alkîne hatî sêwirandin da ku destûrê bide kîmya bitikîne û ji bo taybetmendiya LC/MS/MS dakêşe.
Nîşana şematîkî ya nîşankirina kompleksên proteîn ên ku ji hêla miniSOG ve têne navbeyn kirin.Dema ku li ber ronahiya şîn têne xuyang kirin, şaneyên ku miniSOG-POI îfade dikin oksîjena yekalî çêdikin, ku proteînên hevberdanê diguhezîne lê ne proteînên negirêdayî.Berhemên navîn ên fotooksîtê ji hêla etîketên rele yên lêkolîna kîmyewî ya amine ve têne girtin da ku kêşeyên kovalent ava bikin.Koma alkînîl a li ser sondaya kîmyayê destûrê dide kîmya bitikîne ji bo dewlemendkirina bi vekêşanê û li dûv hejmartina LC-MS/MS.b Avahiya kîmyayî ya sondajên amîn 1-4.c Analîza gêlê ya fluorescent a nûnerî ya nîşankerên proteomîk ên miniSOG-ya navbeynkar ên mîtokondrî bi karanîna sondajên 1-4 û pîvana têkildar a li ser bingeha densîtometrîya gel.Rêjeya sînyala-paşgehê ya sondajên kîmyewî bi karanîna ceribandinên kontrolê yên neyînî ji bilî ronahiya şîn an bi karanîna hucreyên HEK293T bêyî îfadeya miniSOG hate nirxandin.n = 2 nimûneyên serbixwe yên biyolojîkî.Her xal kopiyek biyolojîkî temsîl dike.d Vedîtin û hejmartina nûneriya PDPL bi karanîna sondaya xweşbînkirî 3 di hebûn an nebûna pêkhateyên PDPL yên destnîşankirî de mîna c.n = 3 nimûneyên serbixwe yên biyolojîkî.Her xal kopiyek biyolojîkî temsîl dike.Xetên navendê û tîrêjên navîn û ± vekêşana standard temsîl dikin.CBB: Coomassie Brilliant Blue.e Wêneya konfokal a oksîjena yekalî ya bi reng Si-DMA-ya dûr-sor.Bara pîvanê: 10 μm.Ezmûnên gêl û konfokal bi kêmî ve du caran bi encamên wekhev re serbixwe hatin dubare kirin.
Me pêşî kapasîteya fotosensitîzatorên gihîştî miniSOG26 û KillerRed23, ku bi domdarî di HEK293T de têne xuyang kirin, ceriband ku navbeynkariya nîşankirina propargylamine ya proteome wekî lêpirsînek kîmyewî bike (Hêjmara Pêvek. 1a).Analîzkirina floransê ya gel destnîşan kir ku bi tevahî nîşankirina proteomê bi karanîna miniSOG û tîrêjkirina ronahiya şîn hate bidestxistin, di heman demê de ku bi KillerRed re hilberek nîşankirina xuya nehat dîtin.Ji bo baştirkirina rêjeya sînyala-paşxebatê, me dûv re komek lêkolînên kîmyewî yên ku tê de aniline (1 û 3), propylamine (2), an benzylamine (4) hene ceriband.Me dît ku hucreyên HEK293T bixwe xwedan îşaretek paşîn a bilindtir in li gorî bê ronahiya şîn, dibe ku ji ber hestiyarkerê endojen a riboflavin, flavin mononucleotide (FMN) 27 . Lêpirsînên kîmyewî yên 1 û 3 yên bingehîn ên anilînê taybetmendiyek çêtir dan, digel ku HEK293T bi îstîqrar miniSOG di mitokondriyayê de diyar dike ku ji bo sondaya 3 zêdebûnek> 8 qat nîşan dide, dema ku sondaya 2 di rêbaza nîşankirina RNA de CAP-seq tenê ~2.5- nîşan dide. Zêdebûna sînyala qat, îhtîmal e ku ji ber vebijarkên cihêreng ên reaktîvasyonê di navbera RNA û proteînê de (Wêne. 1b, c). Lêpirsînên kîmyewî yên 1 û 3 yên bingehîn ên anilînê taybetmendiyek çêtir dan, digel ku HEK293T bi îstîqrar miniSOG di mitokondriyayê de diyar dike ku ji bo sondaya 3 zêdebûnek> 8 qat nîşan dide, dema ku sondaya 2 di rêbaza nîşankirina RNA de CAP-seq tenê ~2.5- nîşan dide. Zêdebûna sînyala qat, îhtîmal e ku ji ber vebijarkên cihêreng ên reaktîvasyonê di navbera RNA û proteînê de (Wêne. 1b, c).Lêpirsînên kîmyewî yên 1 û 3 yên bingehîn ên anîlînê taybetmendiyek çêtir nîşan dan: HEK293T, ku miniSOG bi îstîqrar di mitokondriyayê de eşkere dike, ji bo sondaya 3 zêdeyî 8 qat zêdebûnek nîşan dide, dema ku sondaja 2, ku di rêbaza nîşankirina CAP-seq RNA de tê bikar anîn, tenê Zêdebûna sînyala ~ 2,5 qat nîşan dide, dibe ku ji ber vebijarkên cihêreng ên reaktîvîteyê di navbera RNA û proteînê de (Wêne. 1b, c).基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 好 的 特异性, HEK29T 在 线线粒体,, 探针 3 的 信号 增加> 8 倍, 而 用 于 rna 标记 方法 cap-seq 的 探针 2 仅 显示2.5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b，c）。基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 特异性, HEK293T 在在粒体,,,,, 探针 3 的 信号 增加 增加> 8 倍倍 于 于 RNA 标记 cap-eq 的 2 仅 ~ ~ ~ ~ 2.5 -倍信号增加，可能是由于RNALêpirsînên kîmyewî yên 1 û 3 yên li ser bingeha anilînê xwedan taybetmendiyek çêtir bûn, HEK293T bi domdarî miniSOG di mitochondria de diyar kir, û sondaya 3 xwedan 8 qat zêdebûnek nîşanê bû, dema ku sondaya 2 ji bo rêbaza nîşankirina CAP-seq RNA tenê ~ 2,5 qat zêdebûn nîşan da.di sînyalê de, dibe ku ji ber tercîhên reaksiyonê yên cihêreng ên di navbera RNA û proteînê de (Hêjîrê. 1b, c).Wekî din, îzomerên sondajê 3 û sondajên hîdrazînê (lêkolînên 5, 6, 7) hatin ceribandin, ku optimîzasyona sondaya 3 piştrast dike (Hêjmara Pêvek. 1b,c).Bi heman rengî, analîza floransê ya di-gelê de pîvanên ceribandinê yên xweşbînkirî yên din eşkere kir: dirêjahiya pêla tîrêjê (460 nm), giraniya sondaya kîmyewî (1 mM), û dema tîrêjê (20 hûrdem) (Hêjmara Pêvek. 2a-c).Di protokola PDPL de nehiştina hêmanek an gavekê bû sedema vegerandina nîşanek girîng a paşverû (Hêjîrê. 1d).Nemaze, nîşankirina proteînê di hebûna sodyum azide an trolox de, ku tê zanîn ku oksîjena yekalî qut dike, bi girîngî kêm bû.Hebûna D2O, ku tê zanîn ku oksîjena yekalî stabîl dike, nîşana nîşankirinê zêde dike.Ji bo vekolîna tevkariya celebên din ên oksîjenê yên reaktîf di etîketkirinê de, manitol û vîtamîn C hatin zêdekirin ku bi rêzê, 18, 29, hîdroksîl û superoksît radîkalên radîkal ava bikin, lê ew nehat dîtin ku etîketkirinê kêm bikin.Zêdekirina H2O2, lê ne ronîkirin, di etîketkirinê de encam negirt (Hêjmara Pêvek. 3a).Wêneya oksîjena yekalî ya fluorescence bi sondajên Si-DMA hebûna oksîjena yekalî di têla HEK293T-miniSOG de piştrast kir, lê ne di têla HEK293T ya orjînal de.Wekî din, mitoSOX Red nikarî hilberîna superoksîtê piştî ronahiyê tespît bike (Hêjî. 1e û Hêjmara Pêvek. 3b).Cytotoxicity of PDPL di nav de tîrêjkirina ronahiya şîn û lêkolînên kîmyewî de hate nirxandin, û cytotoxicity girîng nehat dîtin (Hêjmara Pêvek. 4a).
Ji bo ku em mekanîzmaya nîşankirinê lêkolîn bikin û bi karanîna LC-MS/MS nasnameya proteomîkî ya kompleksên proteîn bikar bînin, pêşî hewce ye ku em destnîşan bikin ka kîjan asîdên amînî têne guheztin û girseya delta ya etîketên sondajê.Methionine, histidine, tryptophan û tyrosine hatine ragihandin ku ji hêla oksîjena yekgirtî ve têne guhertin14,15.Em tevgera xebatê ya TOP-ABPP31 bi lêgerîna vekirî ya bêalî ya ku ji hêla platforma komputerê ya FragPipe ve li ser bingeha MSFragger32 ve hatî peyda kirin yek dikin.Piştî guheztina oksîjenê ya yekalî û nîşankirina lêkolîna kîmyewî, kîmya bitikîne bi karanîna etîketek kêmkirina biotin ku tê de girêdanek veqetandî vedihewîne, li dûv dirêjkirina neutravidin û digestina trypsin hate kirin.Peptîda guhertî, hîna jî bi resinê ve girêdayî ye, ji bo analîza LC-MS/MS-ê hate kişandin (Wêne 2a û Daneyên Pêvek 1).Hejmarek mezin ji guhertinan li seranserê proteomeyê bi zêdetirî 50 peptîdên nexşeya peptîdê (PSM) lihevhatinên navnîşkirî pêk hatin (Hêjî. 2b).Ecêb e, me tenê guheztina histidine dît, belkî ji ber reaktîvîteya bilind a histidine oksîdkirî ber bi lêkolînên anilîn ve ji asîdên amînî yên din.Li gorî mekanîzmaya çapkirî ya oksîjena histidine ji hêla oksîjena yekalî ve, 21,33 avahiya delta-girseya pêşniyarkirî ya +229 Da bi lêvekirina sonda 3 re bi 2-oxo-histidine re piştî du oksîjenan re têkildar e, dema ku +247 Da hilbera hîdrolîzê ye. ji +229 Da (Hêjmara Pêvek. 5).Nirxandina spektruma MS2 pêbaweriyek bilind a nasîna piraniya y û b îyonan nîşan da, di nav de nasîna îyonên perçeyên guhertî (y û b) (Hêjîra 2c).Analîza naverokê ya rêzika herêmî ya hîstidînên PDPL-guhartî ji bo bermahiyên hîdrofobîk ên piçûk li ±1 pozîsyonan tercîhek motîfek nerm eşkere kir (Hêjmara Pêvek. 4b).Bi navînî, ji her proteînê 1.4 hîstîdîn hatin tespît kirin, û cîhên van nîşankeran ji hêla qada rûbera gihîştî ya çareserker (SASA) û analîza hebûna çareserkerê têkildar (RSA) ve hatin destnîşankirin (Wêjeya Pêvek. 4c,d).
Xebatek bêalî ji bo xwendina hilbijartî ya mayî bi karanîna platforma hesabkirinê ya FragPipe ku ji hêla MSFragger ve hatî hêzdar kirin.Zencîreyên veqetandî di kîmya Click de têne bikar anîn da ku destûr bidin ku peptîdên guhezbar ên ji rezîla streptavidînê veqetînin.Lêgerînek vekirî hate destpêkirin da ku gelek guhertin, û her weha bermahiyên têkildar nas bike.b Girseya guhertinên ku li seranserê proteomeyê çêdibin destnîşan bikin.Peptide nexşeya PSM.c Annotasyona spektral a MS2 ya cihên histidine ku bi sondaya 3-ê ve hatî guheztin. Wekî mînakek nûner, reaksiyona kovalentî ya bi sondaya 3 +229,0938 Da li asîda amînî ya guhertî zêde kir.d Vekolîna mutasyonê ji bo ceribandina nîşankerên PDPL tê bikar anîn.PRDX3 (H155A, H225A) û PRDX1 (H10A, H81A, H169A) ji bo tespîtkirina dij-Flag bi plasmîdên celeb-çovî hatin veguheztin.e Peptîda sentetîk bi miniSOG-a paqijkirî re di hebûna sonda 3 de reaksiyonê hate kirin û hilberên têkildar ên bi Δm +247 û +229 di spektra LC-MS de hatin destnîşan kirin.f Têkiliyên in vitro proteîn-proteîn-proteîn ên ku bi miniSOG-6xHis-tag û antî-6xHis ve têne model kirin.Antîbiotin (streptavidin-HRP) û analîza blotê ya rojavayî ya dijî-mişk ên kompleksên antîbody yên miniSOG-6xHis/anti-6xHis ku bi sondaya 3-ê hatine nîşankirin, li gorî dema rûdana ronahiyê ve girêdayî ye.Nîşaneyên ji bo proteînên kesane di giraniya molekularî ya têkildar de têne diyar kirin: zincîra sivik a antîbody LC, zincîra giran a antîbody HC.Van ceribandinan bi kêmî ve du caran bi encamên wekhev re serbixwe hatin dubare kirin.
Ji bo verastkirina biyokîmyayî ya cîhê nîşankirinê, PRDX3 û PRDX1 ku ji hêla spektrometrîya girseyî ve hatî nas kirin ji histidine bo alanine hatin guheztin û di vekolînên veguheztinê de bi celebê çolê re hatin berhev kirin.Encamên PDPL-ê nîşan da ku mutasyon bi girîngî nîşankirinê kêm kir (Hêjîrê. 2d).Di vê navberê de, rêzikên peptîdê yên ku di lêgerîna vekirî de hatine nas kirin, hatine sentez kirin û di vitro de bi miniSOG-ya paqijkirî re di hebûna sondajê 3 û ronahiya şîn de, bertek nîşan didin, dema ku ji hêla LC-MS ve têne vedîtin (Hêjîrê) 2e).).Ji bo ceribandinê ka proteînên proksîmal ên têkildar dikarin di vitro de wekî bersivdana fotoaktîvkirina miniSOG werin nîşankirin, me bi danûstendina di navbera proteîna miniSOG-6xHis û antî-His monoklona li vitro de ceribandinek nêzîkbûna sûnî sêwirand (Wêne 2f).Di vê ceribandinê de, me li bendê bû ku nîşankirina nêzîk a zincîreyên giran û sivik ên antîbody bi miniSOG.Di rastiyê de, antî-mişk (naskirina zincîrên giran û sivik ên antî-6xHis-labelkirî yên antî-6xHis) û blotên rojavayî yên streptavidîn biotinîlasyonek xurt a zincîrên giran û sivik nîşan dan.Nemaze, me otobiotinylation miniSOG ji ber nîşana 6xHis û girêdanên xaçê di navbera zincîreyên sivik û giran de dît, ku dibe ku bi valahiya ku berê hatî diyar kirin di navbera bersiva lysine û 2-oxo-histidine de têkildar be.Di encamê de, em encam didin ku PDPL bi rengek girêdayî nêzîkbûnê histidine diguhezîne.
Armanca meya paşîn ew bû ku em proteoma subcellular destnîşan bikin da ku taybetmendiya nîşankirina li cîhê ceribandinê bikin.Ji ber vê yekê, me miniSOG bi îstîqrar di navok, matrixa mîtokondrîal, an membrana ER ya derve ya hucreyên HEK293T de diyar kir (Hêjîrê. 3a).Analîza floransê ya gêlê li sê ciyên jêrxaneyî bandên etîketkirî yên zêde û hem jî qalibên etîketkirinê yên cihêreng eşkere kir (Wêne. 3b).Analîzkirina wênekêşiya floransê taybetmendiya bilind a PDPL nîşan da (Hêjîra 3c).Pêvajoya xebata PDPL bi reaksiyonên klîk ên bi rengên rodamîn re hate şopandin da ku proteomên binehucreyî bi karanîna mîkroskopa fluorescence veqetînin, û nîşanên PDPL bi DAPI, şopînerên mîtokondrî, an şopînerên ER-ê re hatin berhev kirin, ku dilsoziya bilind a PDPL piştrast kir.Ji bo sê cihên organel, berhevokek alî-bi-alî ya PDPL bi TurboID re bi karanîna blota rojavayî ya avidin re destnîşan kir ku PDPL li gorî kontrolên wan ên têkildar bi taybetî bêtir hate nîşankirin.Di bin şert û mercên PDPL-ê de, bandên bêtir nîşankirî xuya bûn, ku bêtir proteînên bi PDPL-ê nîşankirî nîşan didin (Hêjmara Pêvek. 6a-d).
Nûneratiyek şematîkî ya nîşankirina proteome ya organel-taybetî ya bi navbeynkariya miniSOG.miniSOG matrixa mîtokondrîyê bi tevhevbûnê digihîne N-termînala 23 asîdên amînî yên COX4-ya mirovî (mito-miniSOG), navokê bi hevgirtina H2B (nucleus-miniSOG), û Sec61b bi hêla sîtoplazmîkî ya perdeya ER (ER-miniSOG). ).Nîşan wênekêşiya gel, wênekêşiya konfokal, û spektrometriya girseyî hene.b Wêneyên gel ên nûner ên sê profîlên PDPL-ya organel-taybetî.CBB Coomassie Brilliant Blue.c Wêneyên konfokal ên nûner ên hucreyên HEK293T ku bi domdarî miniSOG-ê bi cîhên cihêreng ên binehucreyî yên ku ji hêla antîpodê ve hatî nîşankirin V5 (sor) ve bi îstîqrar îfade dikin.Nîşankerên binhucreyî ji bo mîtokondrî û ER (kesk) têne bikar anîn.Pêvajoya xebata PDPL bi karanîna kîmya klîk a Cy3-azîdê vedîtina proteomên binehucreyî yên nîşankirî yên miniSOG (zer) vedihewîne.Bara pîvanê: 10 μm.d Parçeyên volkanîkî yên proteomên bi PDPL-tagkirî yên di organelên cihêreng de ji hêla mîqdarkirina bê nîşankirî ve têne hejmartin (n = 3 ceribandinên biyolojîkî yên serbixwe).T-testa Xwendekarê du dûvik li ser perçeyên volqan hate bikar anîn.Tîpa çolê HEK293T wekî kontrolek neyînî hate bikar anîn. Proteînên ku bi girîngî hatine guheztin bi sor têne ronî kirin (p <0.05 û > 2-qatî cudahiya tundiya îyonê). Proteînên ku bi girîngî hatine guheztin bi sor têne ronî kirin (p <0.05 û > 2-qatî cudahiya tundiya îyonê). Zêdetir belkên cuda cuda yên rengan (p < 0,05 û >2-kurtîna zêdebûnê di intensivity yonov). Proteînên ku bi girîngî hatine guheztin bi sor têne xuyang kirin (p < 0,05 û > 2 qat cudahiya di tundiya ion de).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Zêdetir belkên cuda cuda yên rengên rengîn (p < 0,05 и > 2-kurtnыe razning in ionnoy sile). Proteînên ku bi girîngî hatine guheztin bi rengê sor têne ronî kirin (p <0.05 û > 2-car cudahiya di hêza îyonî de).Proteînên têkildar ji bo HEK293T-miniSOG girîng lê ji bo HEK293T ne girîng in bi kesk têne xuyang kirin.e Analîza taybetmendiya daneyên proteomîk ên ji ceribandinan d.Hejmara giştî ya proteînên girîng ên îstatîstîkî di her organelekê de (nîqteyên sor û kesk) li jorê têne nîşankirin.Histogram proteînên ku li ser bingeha MitoCarta 3.0, analîza GO û A. Ting û al.gel.Ji bo mitochondria, nuclei, û ER daneyên veqetandî.Van ceribandinan bi kêmî ve du caran bi encamên wekhev re serbixwe hatin dubare kirin.Daneyên xav di forma pelên daneya xav de têne peyda kirin.
Ji hêla encamên gêl û wênekêşiyê ve hat teşwîq kirin, pîvandina bê etîket hate bikar anîn da ku proteomeya naskirî di her organelê de bihejmêre (Daneyên Pêvek 2).HEK293T ya neguhastkirî wekî kontrolek neyînî hate bikar anîn da ku nîşangirên paşîn kêm bikin. Analîza plana volkanê proteînên bi girîngî dewlemendkirî nîşan da (p <0,05 û > 2-qatî zexmbûna îyonê) û her weha proteînên yekalî yên ku tenê di xetên miniSOG-îfade dikin de hene (Hêjî. 3d xalên sor û kesk). Analîza plana volkanê proteînên bi girîngî dewlemendkirî nîşan da (p <0,05 û > 2-qatî zexmbûna îyonê) û her weha proteînên yekalî yên ku tenê di xetên miniSOG-îfade dikin de hene (Hêjî. 3d xalên sor û kesk). Analiz grafika vulkana показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-kurtnыe intensivnostь ionov), a dégé nochnыe belki, cotorыe присутствуют только в линиях, ирисыю3, ekspressi. Analîzkirina nexşeya volkanê proteînên bi girîngî dewlemendkirî nîşan da (p<0.05 û >2-qatî tundiya îyonê) û her weha proteînên yekane yên ku tenê di xetên miniSOG-îfade dikin de hene (Hêjî. 3d, xalên sor û kesk).火山图 分析 显示 出 显着 富集 的 蛋白质 (P <0.05 和> 2 倍 离子 存 在于 minisog 表达 系 系 中 的 单一 蛋白质 系 系 系 中 蛋白质 蛋白质 蛋白质 系 系 系 绿色点).火山图 分析 显示 显着 显着 的 蛋白质 (P <0.05 和> 2 倍倍 强度) 仅 存存 在于 minisog 表达 系系 单一 蛋白质 表达 系 的 单一 蛋白质 (图 3D 红色 绿色点 ...))))))))))))))) Analiz grafika вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ionnaya hêza), a также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии на miniSOG и.красн. Analîza nexşeya volkanê proteînên bi girîngî dewlemendkirî (p<0.05 û >2x hêza îyonî) û her weha proteînên yekane tenê di xeta vegotina miniSOG de hene (di Fig. 3d de xalên sor û kesk) eşkere kir.Bi berhevkirina van daneyan, me bi rêzê ve 1364, 461, û 911 proteînên perdeya derveyî ya navokî, mîtokondrîal, û ER-ê bi îstatîstîkî girîng nas kirin.Ji bo analîzkirina rastbûna PDPL-ya organel-herêmî, me MitoCarta 3.0, analîza Gene Ontolojiya (GO) û A. Ting et al.komek daneyan8 ji bo mîtokondrî, navok, û ER-ê hate bikar anîn da ku taybetmendiya organelê ya proteînên kifşkirî ceribandin, ku bi rastbûna 73,4, 78,5, û 73,0% re têkildar e (Wêne. 3e).Taybetmendiya PDPL piştrast dike ku PDPL amûrek îdeal e ji bo naskirina proteomên organel-taybet.Nemaze, analîza submitochondrial ya proteînên mîtokondrî yên naskirî destnîşan kir ku proteoma girtî bi giranî di matrix û membrana hundurîn de (226 û 106, bi rêzê ve) hate belav kirin, ku 91.7% (362) ji hejmara giştî ya proteînên mîtokondrî yên naskirî pêk tê.asteke bilind a PDPL bi ser de hat piştrastkirin (Hêjmara Pêvek. 7a).Bi heman rengî, analîza subnukleer destnîşan kir ku proteoma hatî girtin bi giranî di navok, nukleoplazma, û nukleolusê de hate belav kirin (Hêjmara Pêvek. 7b).Analîza proteomîk a nukleerî ya bi peptîdek sînyala herêmîkirina nukleerî (3xNLS) rastbûnek wekhev a avakirina H2B nîşan da (Hêjmara Pêvek. 7c–h).Ji bo destnîşankirina taybetmendiya nîşana PDPL, laminin A ya nukleerî wekî xefikek POI7-a herêmî ya berbiçavtir hate hilbijartin.PDPL 36 proteînên bi girîngî dewlemendkirî nas kir, ji wan 12 proteîn (30.0% tevî lamin A) proteînên hevberdanê yên lamîn A-yê baş bûn ku ji hêla databasa String ve hatî destnîşan kirin, bi rêjeyek bilindtir ji rêbaza BioID (122 proteîn) 28 ji 28. , 22.9 %) 7. Rêbaza me kêmtir proteîn nas kir, dibe ku ji ber deverên sînorkirî yên nîşankirinê, ku ji hêla oksîjena yekalî ya çalaktir ve hatî çêkirin.Analîza GO destnîşan kir ku proteînên naskirî bi giranî di nukleoplazmayê (26), membrana nukleerê (10), membrana nukleerî (9) û porên nukleerî (5) de cih digirin.Bi hev re, van proteînên navokî yên navokî 80% ji proteînên dewlemendkirî digirin, bêtir taybetmendiya PDPL-ê nîşan didin (Hêjmara Pêvek. 8a-d).
Piştî ku kapasîteya PDPL-ê ji bo pêkanîna nîşankirina nêzîkbûnê di organellan de saz kir, me dûv re ceriband gelo PDPL dikare ji bo analîzkirina hevkarên girêdana POI were bikar anîn.Bi taybetî, me hewl da ku analîza PDPL-ya proteînên sîtosolîk, ku ji ber xwezaya xweya pir dînamîk ji hevpîşeyên xwe yên membran-herêmî wekî armancên dijwartir têne hesibandin destnîşan bikin.Proteîna bromodomain û extraterminal (BET) BRD4 ji ber rola xwe ya sereke di nexweşiyên cihêreng de bala me kişandiye 35, 36.Kompleksa ku ji hêla BRD4 ve hatî çêkirin hevaktîvkerek transkrîpsiyonê û armancek dermankirinê ya girîng e.Bi birêkûpêkkirina îfadeya c-myc û faktorên transkripsiyonê Wnt5a, BRD4 tê fikirîn ku diyarkerek sereke ya leukemiya myeloid a akût (AML), myeloma piralî, lenfoma Burkitt, kansera kolonê û nexweşiyên înflamatuar37,38.Wekî din, hin vîrus BRD4 armanc dikin ku veguheztina vîrus û hucreyî birêkûpêk bikin, wek papillomavirus, HIV, û SARS-CoV-236,39.
Ji bo nexşeya danûstendina BRD4 bi karanîna PDPL-ê, me miniSOG bi isoformek kurt a N- an C-termînalê ya BRD4 re hevûdu kir.Encamên proteomîk di navbera her du avahiyan de astek bilind a hevgirtinê eşkere kir (Hêjmara Pêvek. 9a).Proteoma navokî ya ku bi miniSOG-H2B ve hatî nas kirin 77,6% ji proteînên ku bi BRD4 re têkildar in vedihewîne (Hêjmara Pêvek. 9b).Dûv re, demên cûda yên ronahiyê (2, 5, 10, 20 hûrdem) ji bo sererastkirina tîrêjê nîşankerê hatin bikar anîn (Hêjîr. 4a û daneyên pêvek 3).Em digihîjin encamê ku di heyamên wêneya kurt de, PDPL dê di serî de hevalbendên girêdana rasterast nîşan bide, dema ku demên dirêjtir dê proteînên ku di heyamên kurttir ên fotoaktîvasyonê de têne nas kirin û her weha armancên nerasterast di kompleksên etîketkirinê de vedihewîne.Di rastiyê de, me di navbera xalên dema cîran de hevgirtinek xurt dît (84,6% ji bo 2 û 5 hûrdem; 87,7% ji bo 5 û 10 hûrdem; 98,7% ji bo 10 û 20 hûrdeman) (Hêjî. 4b û Hêjmara Pêvek. 9c).Di hemî komên ceribandinê de, me ne tenê xwe-etîketa BRD4, lê çend armancên naskirî yên wekî MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A, û HMGB1 di databasa rêzê de hatine şîrove kirin.Hêza îyonî ya van armancan bi dema raberkirinê re hevseng e (Hêjîra 4c û Hêjmara Pêvek. 9d).Analîza GO ya proteînên ku di koma 2-deqîqan de hatine nas kirin destnîşan kir ku proteînên naskirî di navokê de cih bûne û di veavakirina kromatînê û fonksiyona RNA polîmerazê de beşdar bûne.Fonksiyona molekulê ya proteînê bi girêdana kromatînê an jî hevaktîvkirina transkrîpsiyonê, bi fonksiyona BRD4-ê re dewlemend bû (Hêjîrê. 4d).Analîza danûstendina proteînê ya ku bi databasa string ve hatî çalak kirin asta yekem a danûstendinên nerasterast di navbera kompleksên hevberdanê yên malbata BRD4 û HDAC de yên wekî SIN3A, NCOR2, BCOR, û SAP130 (Hêjî. 4e û Hêjmara Pêvek. 9e) eşkere kir, ku bi BRD4 û HDAC ve girêdayî histonên acetylated. ..Wekî din, armancên nûner ên ku ji hêla LC-MS/MS ve hatine nas kirin, di nav de Sin3A, NSUN2, Fus, û SFPQ, ji hêla Western blotting ve hatine pejirandin (Hêjîrê 4f).Di van demên dawî de, îzoforma kurt a BRD4 hate ragihandin ku navokên bi taybetmendiyên veqetandina qonaxa şil-avî (LLPS) pêk tîne.Proteînên girêdana RNA Fus û SFPQ navbeynkariya LLPS ya pêvajoyên hucreyî yên cihêreng dikin û li vir wekî proteînên girêdana BRD4-a neqeydkirî hatine nas kirin.Têkiliya di navbera BRD4 û SFPQ de ji hêla ceribandinên hev-immunoprecipitation (hev-IP) ve hate pejirandin (Wêne 4g), mekanîzmayek din a ji bo veqetandina qonaxa şil-avî ya bi navbeynkariya BRD4-ê ku hêjayî lêkolînê ye pêşniyar dike.Bi hev re, ev encam destnîşan dikin ku PDPL platformek îdeal e ji bo naskirina hevberdana BRD4-a naskirî û her weha proteînên girêdana nenas.
Nûneratiyek şematîkî ya nîşankirina nêzîkbûna BRD4-ê bi navbeynkariya miniSOG, demên xuyangkirinê: 2, 5, 10, û 20 hûrdem.b Lihevhatina proteînên ku di demên cûda yên ronahiyê de têne nas kirin.Zêdekirina proteîna ku di HEK293T-miniSOG-BRD4 de hatî nas kirin li gorî HEK293T-ya çolê ji hêla îstatîstîkî ve girîng bû.c Hêza îyonê dema ku proteînên girêdayê BRD4-ê yên naskirî yên nûnerê ne nîşankirî di dema xuyangkirina diyarkirî de hejmartin.n = 3 nimûneyên serbixwe yên biyolojîkî.Daneyên wekî navînî ± veguheztina standard têne pêşkêş kirin.d Analîza ontolojîk a genê (GO) ya proteînên ku di koma 2-deqîqan de hatine nas kirin.Deh şertên pêşîn ên GO têne navnîş kirin.Kulîlk li gorî kategoriya terma GO-yê têne reng kirin, û mezinahiya bilbilê bi hejmara proteînên ku di her termê de têne dîtin re têkildar e.e Analîza string ya proteînên ku bi BRD4 re têkildar in.Derdorên zer benîştek rasterast in û derdorên gewr jî qata yekem a benîştê nerasterast in.Xêzên sor danûstendinên bi ceribandinê hatine destnîşankirin û xetên şîn jî têkiliyên pêşbînîkirî temsîl dikin.f Armancên girêdana nûnerê BRD4-ê ku di LC-MS/MS de hatine nas kirin ji hêla Western blotting ve hatine verast kirin.g Ceribandinên hev-immunoprecipitation pêwendiya di navbera SFPQ û BRD4 de piştrast dikin.Van ceribandinan bi kêmî ve du caran bi encamên wekhev re serbixwe hatin dubare kirin.Daneyên xav di forma pelên daneya xav de têne peyda kirin.
Digel naskirina armancên POI-ya neqeydkirî, em hîpotez dikin ku PDPL dê ji bo naskirina substratên enzîman guncan be, ku hewce dike ku taybetmendiya proteînên girêdana nerasterast di kompleksên mezin de hewce bike da ku substratên neqeydkirî binav bike.Parkîn (ji hêla PARK2 ve hatî kod kirin) lîgazek E3 ye û mutasyonên di parkînê de têne zanîn ku dibin sedema nexweşiya Parkinsonê ya ciwan a autosomal recessive (AR-JP)42.Wekî din, parkîn ji bo mitofagiyê (otofagiya mîtokondrîal) û rakirina celebên oksîjenê yên reaktîf wekî bingehîn tê binav kirin.Lêbelê, her çend çend substratên parkînê hatine nas kirin jî, rola parkînê di vê nexweşiyê de ne diyar e.Ji bo şîrovekirina substratên xwe yên nenaskirî, PDPL bi lê zêdekirina miniSOG li N- an C-dawiya parkînê hate ceribandin.Ji bo ku parkînê bi riya PINK1-Parkin veguhezîne hucreyan bi karbonyl cyanide veguhezkarê proton m-chlorophenylhydrazone (CCCP) ve were derman kirin.Li gorî encamên BRD4 PDPL-ya me, fusion N-terminus parkin komek mezintir proteînên armanc eşkere kir, her çend ew beşek mezin a C-terminus (177 ji 210) vedigire (Wêne 5a,b û Daneyên Pêvek 4).Encam bi raporên ku nîşaneyên N-termînalê dikarin bi awakî şaş Parkin44 çalak bikin re hevaheng e.Ecêb e, di daneyên me de tenê 18 proteînên hevgirtî bi encamên AP-MS-ê yên ji bo Parkin43 hatine weşandin, dibe ku ji ber cûdahiyên di navbera xetên hucreyê û tevgerên proteomîkê de.Ji bilî çar proteînên naskirî (ARDM1, HSPA8, PSMD14, û PSMC3) ku bi du rêbazan têne naskirin (Hêjîr. 5c)43.Ji bo bêtir rastdarkirina encamên LC-MS/MS, dermankirina PDPL û dûv re blota rojavayî hate bikar anîn da ku encamên ceribandina hucreya dêûbav HEK293T û xeta parka N-termînalê ya stabîl bidin berhev.Armancên berê yên nenas CDK2, DUT, CTBP1, û PSMC4 bi binderek naskirî, DNAJB1 ve hatin ceribandin (Wêne. 5d).
Di şaneyên HEK293T de proteînên volqan ên ku bi parkînê ve girêdayî ne, bi miniSOG-ya bi îstîqrar ve hatî xuyang kirin ku bi N- an C-dawiya parkînê ve tê hev kirin (n = 3 ceribandinên biyolojîkî yên serbixwe).T-testa Xwendekarê du dûvik li ser perçeyên volqan hate bikar anîn.HEK293T wekî kontrolek neyînî hate bikar anîn. Proteînên ku bi girîngî hatine guheztin bi sor têne ronî kirin (p <0.05 û > 2-qatî cudahiya tundiya îyonê). Proteînên ku bi girîngî hatine guheztin bi sor têne ronî kirin (p <0.05 û > 2-qatî cudahiya tundiya îyonê). Zêdetir belkên cuda cuda yên rengan (p < 0,05 û >2-kurtîna zêdebûnê di intensivity yonov). Proteînên ku bi girîngî hatine guheztin bi sor têne xuyang kirin (p < 0,05 û > 2 qat cudahiya di tundiya ion de).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Zêdetir belkên cuda cuda yên rengên rengîn (p < 0,05 и > 2-kurtnыe razning in ionnoy sile). Proteînên ku bi girîngî hatine guheztin bi rengê sor têne ronî kirin (p <0.05 û > 2-car cudahiya di hêza îyonî de).Proteînên têkildar ji bo HEK293T-miniSOG girîng lê ji bo HEK293T ne girîng in bi kesk têne xuyang kirin.b Diyagrama Venn ku proteînên lihevkirî yên di navbera pêkhateyên N-termînalê û C-termînalê de nîşan dide.Etîketên N-termînalê dikarin parkînê bi rengekî bêkêmasî çalak bikin û proteînên bêtir naskirî encam bidin.c Diyagrama Venn ku proteînên hevgirtî di navbera PDPL û AP-MS de nîşan dide.Têkiliyên naskirî têne navnîş kirin, di nav de 4 ji 18 proteînên hevgirtî û 11 ji 159 proteînên ku bi taybetî di PDPL-ê de têne nas kirin.d Armancên nûner ên ku ji hêla LC-MS/MS ve hatine nas kirin ji hêla Western blotting ve hatine verast kirin.e Ssu72 û SNW1 wekî substratên parkînê yên neqeydkirî hatin nas kirin.Van plasmîdên proteîn ên FLAG-ê nîşankirî di nav HEK293T û HEK293T-Parkin-miniSOG de hatin veguheztin û dûv re jî dermankirina CCCP di demên cihêreng de.Xerabûn di xeta zêdederbirînê ya Parkin de bêtir diyar bû.f Bi karanîna astengkerê proteazomê MG132, hate pejirandin ku pêvajoya hilweşandina Ssu72 û SNW1 bi navbeynkariya proteasome-ubiquitination ve tête kirin.Van ceribandinan bi kêmî ve du caran bi encamên wekhev re serbixwe hatin dubare kirin.Daneyên xav di forma pelên daneya xav de têne peyda kirin.
Nemaze, proteînên ku ji hêla PDPL ve têne nas kirin divê proteînên parkîn-girêdan û substratên wan hebin.Ji bo tespîtkirina substratên parkînê yên neqeydkirî, me heft proteînên naskirî (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 û SNW1) hilbijart û plasmîdên veguheztin da ku van genan li HEK293T-ya normal derxînin holê û bi îstîqrar dermankirina miniSOG-Parkin3T ya ku li dû HEK2-yê tê xuyang kirin.Asta proteînên Ssu72 û SNW1 di rêza miniSOG-Parkin a îstîqrar de bi girîngî kêm bûn (Wêne. 5e).Dermankirina bi CCCP ji bo 12 demjimêran di hilweşîna herî girîng a her du substratan de encam da.Ji bo vekolînê bê ka hilweşîna Ssu72 û SNW1 bi proteazomê-ubiquitination ve tê rêkûpêk kirin, mêldarê proteazomê MG132 hate zêdekirin ku çalakiya proteazomê asteng bike, û bi rastî me dît ku pêvajoya hilweşandina wan hate asteng kirin (Hêjî. 5f).Armancên ne-substrate yên zêde wekî înterakterên Parkinê bi karanîna Western blottingê hatine pejirandin (Wêjeya Pêvek. 10), ku encamên domdar bi LC-MS/MS re nîşan didin.Di encamê de, entegrasyona xebata PDPL-ê bi verastkirina veguheztina proteîna armanc re destûrê dide nasîna substratên E3 ligase yên neqeydkirî.
Me platformek nîşankirina nêzikbûnê ya hevpar pêşxistiye ku dihêle hûn di cîh û demê de POI-yên hevberdanê nas bikin.Platform li ser bingeha proteîna miniSOG photosensitizer, ku tenê bi qasî 12 kDa ye, ji nîvê mezinahiya enzîma APEX2 ya gihîştî (27 kDa) û yek sêyek mezinahiya TurboID (35 kDa) kêmtir e.Mezinahiya piçûktir divê ji bo lêkolîna interaktomên proteînên piçûk rêza serlêdanan pir berfireh bike.Zêdetir keşfkirina wênekêşkerên din, çi proteînên kodkirî yên genetîkî an jî molekulên piçûk, hewce ye ku hilberîna kuantum a oksîjena yekalî zêde bike û hestiyariya vê nêzîkatiyê berfireh bike.Ji bo guhertoya heyî ya miniSOG, çareseriya demkî ya bilind dikare bi karanîna ronahiya şîn were bidestxistin da ku nîşangirên nêzîkbûnê çalak bike.Digel vê yekê, dema dirêjtir xuyangê "ewrek" mezin a oksîjena yekalî berda, di encamê de guheztina bermahiyên hîstidîna dûrtir, zêde tîrêjê nîşankirinê, û şiyana başkirina çareseriya cîhê PDPL-ê.Di heman demê de me heft sondajên kîmyewî ceriband da ku rêjeya sînyala-paşxebatê zêde bike û mekanîzmaya molekulê ya li pişt vê nêzîkatiyê lêkolîn kir.Xebata TOP-ABPP ya bi lêgerîna vekirî ya bêalîbûyî re hevgirtî piştrast kir ku guheztin tenê di hîstidînan de çêbûne û ji bo zêdekirina guheztinên histidine tu mîkro hawîrdorek domdar nehate dîtin, ji bilî tercîhek nerm ji bo hîstidînan li herêma loop.
PDPL di heman demê de ji bo taybetmendîkirina proteomên binehucreyî yên bi taybetmendî û vegirtina proteome bi kêmî ve bi awayên din ên nîşankirina nêzîkbûnê û rêbazên lêkolîna kîmyewî-taybetî organel ve hatî berhev kirin jî hatî bikar anîn.Nîşaneyên nêzîkbûnê jî bi serfirazî hatine bikar anîn da ku proteomên rûkal, lîzozomî, û bi sekretome re têkildar diyar bikin46,47.Em bawer dikin ku PDPL dê bi van organelên jêrxaneyî re hevaheng be.Wekî din, me PDPL-ê bi destnîşankirina armancên ji bo girêdana proteîna sîtosolîk ên ku ji proteînên girêdayî membranê tevlihevtir in, ji ber taybetmendiyên wan ên dînamîkî û tevlêbûna di danûstendinên demkî yên bêtir de dijwar kirin.PDPL li du proteînan hate sepandin, hevaktîvatorê transkrîpsiyonê BRD4 û lîgaza E3 Parkin a bi nexweşiyê ve girêdayî ye.Ev her du proteîn ne tenê ji bo fonksiyonên wan ên bingehîn ên biyolojîkî, lê di heman demê de ji bo girîngiya wan a klînîkî û potansiyela dermankirinê jî hatine hilbijartin.Ji bo van her du POI, hevkarên girêdanê yên naskirî û her weha armancên neqeydkirî hatin nas kirin.Nemaze, proteîna SFPQ-a-girêdayî veqetandina qonaxê ji hêla co-IP-ê ve hate pejirandin, ku dibe ku mekanîzmayek nû destnîşan bike ku BRD4 (îzoforma kurt) LLPS-ê rêve dike.Di heman demê de, em bawer dikin ku nasîna substratên Parkin senaryoyek e ku tê de nasîna adhesives nerasterast hewce ye.Me du substratên parkînê yên nenas nas kirin û hilweşîna wan li ser riya ubiquitination-proteasome piştrast kir.Di van demên dawî de, stratejiyek girtina mekanîzmayê hate pêşve xistin da ku substratên hîdrolasê bi girtina wan bi enzîman re kifş bike.Her çend ev rêbazek pir bi hêz e jî, ji bo analîzkirina substratên ku di avakirina kompleksên mezin de cih digirin ne guncaw e û pêdivî bi avakirina girêdanên kovalentî di navbera enzîm û substratê de heye.Em hêvî dikin ku PDPL dikare were dirêj kirin da ku kompleksên proteîn û malbatên enzîmê yên din, wekî malbatên deubiquitinase û metalloprotease lêkolîn bike.
Formek nû ya miniSOG, bi navê SOPP3, bi hilberîna oksîjena yekalî ya çêtir hatî pêşve xistin.Me miniSOG bi SOPP3 re dan ber hev û performansa nîşankirinê ya çêtir dît, her çend rêjeya sînyala-bo-deng neguherî jî (Hêjmara Pêvek. 11).Me hîpotez kir ku xweşbînkirina SOPP3 (mînak, bi riya pêşkeftina rêwerzkirî) dê bibe sedema proteînên hestiyarker ên bikêrtir ên ku hewceyê demên ronahiyê kurttir in û bi vî rengî rê dide ku pêvajoyên hucreyî yên dînamîkî werin girtin.Nemaze, guhertoya heyî ya PDPL bi hawîrdora hucreyî ve sînorkirî ye ji ber ku ew ronahiya ronahiya şîn hewce dike û nikare têkeve nav tevnên kûr.Ev taybetmendî bikaranîna wê di lêkolînên modela heywanan de asteng dike.Lêbelê, berhevoka optogenetîk bi PDPL re dikare ji bo lêkolîna heywanan, nemaze di mêjî de, derfetek peyda bike.Wekî din, fotosensitîzatorên din ên infrared ên endezyarkirî jî vê sînorkirinê radikin.Niha di vî warî de lêkolîn tên kirin.
Rêza hucreya HEK293T ji ATCC (CRL-3216) hate wergirtin.Rêza hucreyê ji bo enfeksiyona mycoplasma neyînî ceriband û di DMEM (Thermo, #C11995500BT) de hate çandin ku bi 10% seruma fetal bovine (FBS, Vistech, #SE100-B) û 1% penîsîlîn / streptomycin (Hyclone, #SV30010) tê çandin.mezin bûye.
3-Aminophenylene (nimûneya 3) û (4-etynylphenyl)methanamine (nimûneya 4) ji Bidepharm hatin kirîn.Propylamine (lêkolînek 2) ji Energy-kîmyewî hate kirîn.N-(2-Aminophenyl)pent-4-ynamide (lêkolînek 1) li gorî rêbazên çapkirî hate sentez kirin.
Tabloya Pêvek 1 avahîyên genetîkî yên ku di vê lêkolînê de hatine bikar anîn navnîş dike.Rêzên miniSOG û KillerRed ji plasmîdek diyarî ya P. Zou (Zanîngeha Peking) hatin klon kirin.Rêzeya armanckirina matrixê ya mîtokondrî ji 23 asîdên amînî yên N-termînalê yên COX4 hate derxistin û di vektorên destnîşankirî de bi karanîna meclîsek Gibson hate klon kirin (Beyotime, #D7010S).Ji bo armanckirina membran û navokê retîkûlûma endoplazmî, SEC61B DNAya mirovî (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) bi PCR-ê ji pirtûkxaneyek cDNA ya hucreyên HEK293T, û DNA H2B (ji hêla D. Lin, Laboratory Shenzhen Bay ve hatî dayîn) hatî zêdekirin. û klon kirin, wekî ku li jor hatî destnîşan kirin.Heya ku wekî din neyê destnîşan kirin, genên proteîn ên din ên ku ji bo veguheztin û avakirina xêzên hucreyên stabîl têne bikar anîn PCR ji pirtûkxaneya cDNA ya hucreya HEK293T hatine zêdekirin.G3S (GGGS) û G4S (GGGGS) wekî girêdan di navbera proteîna bait û miniSOG de hatin bikar anîn.Etîketek epîtopê ya V5 (GKPIPNPLLGLDST) li van avahiyên hevgirtinê hate zêdekirin.Ji bo vegotina di mammalan de û ji bo damezrandina xêzek hucreyek bi îstîqrar, avakirina fusion miniSOG di vektora lentiviral pLX304 de hate binklon kirin.Ji bo vegotina bakterî, miniSOG di vektora pET21a ya ku bi 6xHis ve hatî nîşankirin li C-terminus hate klon kirin.
Hucreyên HEK293T bi 2,0 x 105 şaneyên ji bo her bîrekê di lewheyên şeş-kaniyê de hatin çandin û 24 demjimêran şûnda bi plasmîdên lentîviral ên rekombînant (2,4 μg pLX304) û plasmîdên pakkirinê yên vîrusê (1,5 μg psPAX2 û 1,2 μg psPAG2 û 1,2 μg) wextê bi 0Bepo2 ve hatin veguheztin (0Bepo2). , #C0533), nêzîkî 80% fusion.Piştî veguheztina şevekê, navgîn hate guheztin û 24 demjimêrên din înkuba kirin.Komkirina vîrusê piştî 24, 48 û 72 saetan pêk hat.Berî enfeksiyona xêzên hucreyên armanc, navgîniya vîrus di nav parzûnek 0.8 μm (Merck, #millex-GP) de hate parzûn kirin û polybrene (Solarbio, #H8761) bi giraniya 8 μg / ml hate zêdekirin.Piştî 24 demjimêran, hucre bi guherandina navgînê ve hatin destûr kirin.Hucreyên bi karanîna 5 μg / ml blasticidin (Solarbio, #3513-03-9) ji bo sê rêgezên yekem wekî hilbijarkek hişk a jêrîn hatin hilbijartin.Dûv re 20 μg / ml wekî rejîmek hişktir ji bo sê rêyên din tê bikar anîn.
Hucre di jûreyên 12-kaniyê de (Ibidi, #81201) bi tîrêjek bi qasî 20,000 hucreyan li her bîrê hatin çandin.Ji bo baştirkirina girêdana hucreyên HEK293T, 50 μg/ml fibronectin (Corning, #356008) ku di salona tampon a fosfatê (PBS, Sangon, #B640435) de di 37°C de hatî rijandin lê zêde bikin.Ode ji bo 1 saetan pêşî hatin derman kirin û dûv re bi PBS hatin rakirin.Piştî 24 saetan, şaneyên carekê bi PBS hatin şûştin, bi 1 mM sondajê 3 di nav çareserîya xwêya hevseng a Hanksê ya nû (HBSS, Gibco, #14025092) de 1 saetan li 37°C hatin şûştin, û dûv re bi LEDek şîn (460 nm) hatin inkubasyon. ).) 10 hûrdeman li germahiya odeyê hatin tîrêj kirin.Piştî wê, hucre du caran bi PBS hatin şuştin û bi 4% formaldehyde di PBS (Sangon, #E672002) de 15 hûrdem li germahiya odeyê hate sax kirin.Zêdeyî formaldehîde ji şaneyên sabît bi sê caran şuştina bi PBS hate derxistin.Dûv re şaneyên bi 0,5% Triton X-100 (Sangon, #A600198) di PBS de hatin permeabilîzekirin û 3 caran bi PBS hatin şûştin.Dûv re jûreyê derxînin û 25 μl tevliheviya reaksiyonê ya klîk a ku tê de 50 µM Cy3-azîd (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4) tê de hene, li her nimûneyê zêde bikin. û 0,5 mg/ml askorbata sodyûmê (Aladdin, no. S105024) û 30 hûrdeman li germahiya odeyê tê avêtin.Piştî reaksiyonek zû, hucre şeş caran bi PBS-ê ku 0,05% Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST) vedihewîne, hatin şûştin û dûv re bi 5% BSA (Abcone, #B24726) di PBST de 30 hûrdem li germahiya odeyê hate asteng kirin.
Ji bo îmmunostainkirina kolokalîzasyonê, hucre li gorî şert û mercên destnîşankirî bi antîbodên seretayî ve hatin inkubasyon: mişk antî-V5 tag mAb (1:500, CST, #80076), rabbit antî-Hsp60 mAb (1:1000), ABclonal, #A0564), Antîpîşeya antî-calnexinê polîklonal kewroşkê (1:500, Abcam, #ab22595) an antî-lamîn A/C monoklonal a keroşkê (1:500; CST, #2032) di şevekê de li 4 °C.Piştî şuştina 3 caran bi PBST, şaneyên bi antîbodên duyemîn hatin înkubakirin: Alexa Fluor 488 (Thermo, #A11034) dilîve 1:1000, bizinê dijî-mişk Alexa Fluor 594 (CST, #8889) 1:10 rijandin.Dilution Di germahiya odeyê de ji bo 30 deqîqeyan vekin.Dûv re şan 3 caran bi PBST hatin şûştin û bi DAPI (Thermo, #D1306) di PBS de 10 hûrdem li germahiya odeyê hatin reng kirin.Piştî 3 şuştinên bi PBS, hucreyên ji bo wênegirtinê di 50% glycerol (Sangon, #A600232) de di PBS de hatin girtin.Wêneyên immunofluorescent bi karanîna mîkroskopa konfokal a ZEISS LSM 900 Airyscan2 û nermalava ZNE 3.5 hatin wergirtin.
Ji bo nîgarkêşana fluorescent a oksîjenê ya yekta, hucre du caran bi tampon Hanks HEPES hatin şûştin berî ku 100 nM Si-DMA li tampon Hanks HEPES (DOJINDO, #MT05) zêde bikin.Piştî ronahiyê, şaneyên di inkubatorek CO2 de di 37 ° C de ji bo 45 deqîqeyan têne avêtin.Dûv re şaneyên du caran bi tampona Hanks' HEPES hatin şûştin û bi Hoechst di tampona Hanks' HEPES de 10 hûrdeman li germahiya odeyê hatin şûştin û bi mîkroskopa konfokal a ZEISS LSM 900 hate xuyang kirin., #M36008) di tampon HBSS de ku kalsiyûm û magnesium heye.Piştî girtina ronahiyê an jî doxorubicin (MCE, #HY-15142A), şaneyên di înkubatoreke CO2 de li 37° C. ji bo 10 deqîqeyan hatin şûştin, du caran bi tampon HBSS hatin şûştin, û bi Hoechst di tampon HBSS de li germahiya odeyê hatin înkubakirin.minutes.Doxorubicin wekî kontrolek lêkolînê ya erênî hate bikar anîn ku li wê derê şaneyên bi 20 μM doxorubicin di HBSS de ku 1% BSA heye ji bo 30 hûrdeman hatin derman kirin.Wêneyên immunofluorescent bi karanîna mîkroskopa konfokal a Zeiss LSM 900 hatin wergirtin.
Hucreyên HEK293T yên ku mito-miniSOG bi domdarî diyar dikin, bi dendika nêzîkê 30% di sêlên 15 cm de hatin çandin.Piştî 48 demjimêran, dema ku %80% gihîştin hev, şaneyên carekê bi PBS hatin şûştin, bi 1 mM Probe 3 di tampon HBSS ya nû de 1 saetê li 37°C hatin inkub kirin û dûv re bi LEDek şîn 10 hûrdeman li odeyê ronî kirin. germî..Dûv re, hucre du caran bi PBS-ê hatin şûştin, hatin şûştin û di tamponek PBS-sar a qeşa-sar de ku tê de frensiyonên proteazê yên bê EDTA hene (MCE, #HY-K0011) hatin şûştin.Hucre bi sonickirina tîpê ji bo 1 hûrdemê (1 çirkeyek û 1 çirkeyek ji 35% amplitude) hatin lîz kirin.Tevliheviya encam di 15,871 xg de ji bo 10 hûrdeman li 4 °C hate santrîfuj kirin da ku bermahiyê jê bibe, û giraniya supernatant bi 4 mg/mL bi karanîna kîtek testa proteîna BCA (Beyotime, #P0009) hate sererast kirin.1 ml ji lîzata jorîn bi 0,1 mM biyotin azide (Confluore, #BBBD-14), 1 mM TCEP (Sangon, #A600974), 0,1 mM lîganda TBTA (Aladdin, #T162437), û 1 mM bi SO4 incub re hev bikin. 1 saet li germahiya odeyê bizivirîne.Piştî reaksiyonek zû, tevliheviyê di nav şûşeyek cam a 10 ml de têxin nav çareseriya berî tevlihev (MeOH:CHCl3:H2O = 4 ml:1 ml:3 ml).Nimûne hatin tevlihev kirin û di germahiya odeyê de 10 hûrdeman di 4500 g de santrîfuj kirin.Çareseriyên jêrîn û jorîn hatin avêtin, rijandin du caran bi 1 ml metanol hate şuştin û li 15871 × g 5 hûrdeman li 4 ° C santrîfuj kirin.1 ml urea 8 M (Aladdin, no. U111902) li 25 mM amonyum bîkarbonat (ABC, Aladdin, no. A110539) lê zêde bikin da ku berfê bihelîne.Nimûne bi 10 mM dithiothreitol (Sangon, #A100281 di 25 mM ABC de) ji bo 40 hûrdeman li 55°C ji nû ve hatin çêkirin û dûv re 15 mM iodoacetamide nû (Sangon, #A600539) li germahiya odeyê di tariyê de zêde kirin.Di nav 30 hûrdeman de alkîlasyon..Ji bo rawestandina reaksiyonê 5 mM dîthiothreitolek din hate zêdekirin.Bi şuştina 3 caran bi 1 ml PBS, ji bo her nimûneyê bi qasî 100 µl mişkên NeutrAvidin agarose (Thermo, #29202) amade bikin.Çareseriya proteomê ya jorîn bi 5 ml PBS re hate rijandin û bi mûçikên NeutrAvidin agarose yên ku ji berê ve hatine şuştin 4 demjimêran li germahiya odeyê hate înkuba kirin.Dûv re mişk 3 caran bi 5 ml PBS ku %0,2 SDS tê de heye (Sangon, #A600485), 3 caran bi 5 ml PBS ku 1M urea tê de heye, û 3 caran bi 5 ml ddH2O hatin şûştin.Dûv re mişk bi santrîfugê hatin berhev kirin û di 200 μl 25 mM ABC de ku 1 M urea, 1 mM CaCl 2 (Macklin, #C805228) û 20 ng/μl trîpsîn (Promega, #V5280) vedihewîne, ji nû ve hatin sekinandin.Trypsinize bi şev di 37°C de bi zivirandinê.Reaksîyon bi lê zêdekirina asîdê formîk (Thermo, # A117-50) hate rawestandin heya ku pH gihîşt 2-3.Kulîlk 3 caran bi 1 ml PBS ku %0,2 SDS tê de ye, 3 caran bi 1 ml PBS ku 1 M urea tê de heye, û dûv re 3 caran bi 1 ml ava distîlkirî re hatin şûştin.Peptîdên guhertî bi lîza ronahiyê (365 nm) ji bo 90 hûrdemî bi karanîna 200 μl 70% MeOH hatin berdan.Piştî santrîfujasyonê, supernatant hate berhev kirin.Dûv re mêş carekê bi 100 μl 70% MeOH hatin şûştin û zêrên sergirtî hatin berhev kirin.Nimûne di koncentratora valahiya Speedvac de hatin hişk kirin û heya analîzê di -20°C de hatin hilanîn.
Ji bo naskirin û hejmartina peptîdên guhezbar ên oksîjenê yên yekalî, nimûne di 0.1% asîda formîk de ji nû ve hatin hilweşandin û 1 μg peptîd bi karanîna spektrometerek girseyî ya Orbitrap Fusion Lumos Tribrid ku bi çavkaniyek nano ESI ji Tune û Xcalibur ji nermalava firoşkar 4.3 ve hatî vekolîn kirin.Nimûne li ser stûnek kapîlar a 75 μm × 15 cm bi 3 μm materyalê C18 (ReproSil-pur, #r13.b9.) veqetandî û bi pergalek EASY-nLC 1200 UHPLC (Thermo) ve hatin veqetandin.Peptîd bi kromatografiya gradientê ya xêzkirî ya 95 hûrdemî ji 8% helwêst B berbi 50% helaw B (A = 0.1% asîda formîk di avê de, B = 0.1% asîda formîk di 80% acetonitrile de) hatin veqetandin, dûv re bi xêzikî 98% B min. di 6 hûrdeman de bi rêjeya herikîna 300 nl/min.Orbitrap Fusion Lumos li gorî daneyê di navbera şopandina tevahî MS û şopandina MS2 de daneyan berhev dike.Voltaja rijandinê li ser 2,1 kV hate danîn û germahiya kapîlara veguheztina îyonê 320 ° C bû.Spektrên MS (350-2000 m/z) bi çareseriya 120,000, AGC 4 × 105, û dema têketina herî zêde 150 ms hatin berhev kirin.10 pêşnûmeyên pir-barkirî yên herî gelemperî di her skînek tevahî de bi karanîna HCD-ê bi enerjiya têkçûnê ya normalkirî ya 30%, pencereyek veqetandina çar-polê ya 1.6 m/z, û mîhengek çareseriyê ya 30,000 perçe kirin.Hedefek AGC ji bo spektrometriya girseyî ya tandem bi karanîna 5 × 104 û dema têketina herî zêde 150 ms.Îstîsna dînamîk ji bo 30 çirkeyan hatiye danîn. Ji bo MS/MS îyonên nenaskirî an jî yên bi bareya 1+ û >7+ hatine red kirin. Ji bo MS/MS îyonên nenaskirî an jî yên bi bareya 1+ û >7+ hatine red kirin. Nenasînnыe ionы an ionы bi 1+ û >7+ bыli отклонены dlya MS/MS. Ji bo MS/MS îyonên nenaskirî an îyonên bi barkirina 1+ û >7+ hatin red kirin.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Nexazannыe ionы or ionы с зарядами 1+ и >7+ bыli отклонены для МС/МС. Îyon an îyonên nenaskirî yên bi barên 1+ û >7+ ji bo MS/MS hatin red kirin.
Daneyên xav bi karanîna platforma komputerê ya FragPipe li ser bingeha MSFragger têne hilberandin.Nerazîbûnên girseyî û asîdên amînî yên têkildar bi karanîna algorîtmayek lêgerîna vekirî bi toleransek girseyî ya -150 heta 500 Da hatin destnîşankirin.Dûv re peptîdên guhertî bi karanîna guheztinên histidine bi destkeftiyên girseyî yên +229.0964 û +247.1069 Da li PD (Proteome Discoverer 2.5, Thermo) hatin nas kirin.
Hucreyên ku bi domdarî gena miniSOG ya hevgirtî îfade dikin, di sêlên 6 cm de hatin vedan.Piştî gihîştina% 80% lihevhatinê, hucre carek bi HBSS (Gibco, #14025092) hatin şûştin, dûv re bi sondajên kîmyewî di HBSS de 1 saet di 37°C de hatin înkubakirin û bi ronahiya şîn hatin ronî kirin.10W LED ji bo 20 deqîqeyan li germahiya odeyê.Ji bo destnîşankirina kîjan celeb celebên oksîjena reaktîf di PDPL de, 0.5 mM vîtamîn C (MCE, #HY-B0166), 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0) ve girêdayî ye, 100 mM manitol (Energy Chemical, #69-65-8), 100 μM H2O2, 10 mM NaN3 wekî pêvek li şaneyan hatin zêdekirin.Piştî şuştina bi PBS sar, hucre hatin şûştin, di lûleyên santrîfujê yên 1,5 ml de hatin berhev kirin, û 1 hûrdem li 200 μl PBS bi 1x înhîbîtorê proteazê bê EDTA (1 s û 1 s bê, amplîtuda 35%) bi tîpek sonik kirin.Tevliheviya encam di 15,871 × g de ji bo 10 hûrdeman li 4 °C hate santrîfuj kirin û bi karanîna kîteyek testa proteîna BCA-ê bi 1 mg/mL hate verast kirin.Nêzîkî 50 μl ji lîzata jorîn bi 0,1 mM rhodamine azide (Aladdin, no. T131368), 1 mM TCEP, 0,1 mM TBTA lîgand, û 1 mM CuSO4 ji bo 1 saetê li germahiya odeyê bi zivirîna ji binî ber bi jor ve hate înkubakirin.Piştî reaksiyona klîk, barîna bi acetonê bi zêdekirina 250 μl asetonê berî-sarkirî li nimûneyan hate kirin, 20 hûrdem li -20 °C înkuba kirin û li 6010×g ji bo 10 hûrdeman li 4 °C santrîfuj kirin.Pelê kom bikin û di 50 µl 1x tampon Laemmli de 10 hûrdeman di 95 °C de bihelînin.Dûv re nimûne li ser gêlên dirêj ên SDS-PAGE hatin analîz kirin û bi karanîna pergala wênekêşana Bio-rad ChemiDoc MP Touch bi nermalava Image Lab Touch ve hatin xuyang kirin.
Vebijandin û paqijkirina proteîna miniSOG-6xHis ya rekombînant wekî ku berê hatî destnîşan kirin hate kirin.Bi kurtasî, hucreyên E. coli BL21 (DE3) (TransGen, #CD701-02) bi pET21a-miniSOG-6xHis ve hatin guheztin û îfadeya proteînê bi 0.5 mM IPTG (Sangon, #A600168) hate çêkirin.Piştî lîza hucreyê, proteîn bi karanîna berikên agarose yên Ni-NTA (MCE, no. 70666) hatin paqij kirin, li dijî PBS hatin dialîz kirin, û li -80°C hatin hilanîn.
Ji bo vekolînek nêzîkbûna etîketa li vitro ya li ser bingeha antîpotê, 100 μM miniSOG paqijkirî, 1 mM sonda 3, û 1 μg antî-labelê monoklonal a mişkê (TransGen, #HT501-01) di PBS de bi tevahî reaksiyonê 50 μl tevlihev bikin..Tevra reaksiyonê bi ronahiya LED ya şîn 0, 2, 5, 10, û 20 hûrdem li germahiya odeyê hate tîrêj kirin.Tevlîhev bi 0.1 mM biotin-PEG3-azîd (Aladdin, #B122225), 1 mM TCEP, 0.1 mM TBTA lîgand, û 1 mM CuSO4 1 demjimêran li germahiya odeyê li ser hejkerek tevgerê ya jor ve hate înkubakirin.Piştî reaksiyonek zû, 4x tampon Laemmli rasterast li tevlêkirinê zêde bikin û li 95°C 10 hûrdeman bikelînin.Nimûne li ser gêlên SDS-PAGE hatin analîz kirin û bi western blotting bi streptovidin-HRP (1:1000, Solarbio, #SE068) hatin analîz kirin.
Peptîdek sentetîk a hîstidîn-a xwedan bi amîdasyona C-termînalê (LHDALDAK-CONH2) hate bikar anîn da ku etîketkirina in vitro-bingeha peptîdê nêzîk analîz bike.Di vê ceribandinê de, 100 μM miniSOG paqijkirî, 10 mM sondaj 3 û 2 μg/ml peptîdê sentetîk di PBS de di navberek reaksiyonê ya tevahî 50 μl de tevlihev bûn.Tevra reaksiyonê bi ronahiya LED şîn 1 saetê li germahiya odeyê hate tîrêj kirin.Mîkrolîtreyek nimûneyê bi karanîna pergalek LC-MS (Waters, SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight bi nermalava analîzkirina spektrumê MassLynx) hate analîz kirin.
Hucreyên HEK293T ku bi îstîqrar gena miniSOG-ê ya hevberdanê îfade dikin, di sêlên 10 cm de ji bo xêzên xwedan cîhê organelên cihêreng (Mito, ER, Nucleus) û sêlên 15 cm ji bo xetên Parkin-miniSOG û BRD4-miniSOG hatin çandin.Piştî gihîştina% 90% lihevhatinê, hucre carek bi HBSS hatin şûştin, dûv re bi sondaya 3 li HBSS 1 saetê li 37°C hatin inkubasyon kirin û bi LEDek şîn a 10 W li germahiya odeyê hate ronî kirin.Ji bo nîşankirina bê-têkilî ya Parkin, 10 μM proton karbonîl cyanide hilgirê m-chlorophenylhydrazone CCCP (Solarbio, #C6700) bi sondaya 3 di HBSS de ji bo 1 saetê li 37 °C hate zêdekirin.Pêngavên lîza şaneyê, kîmya klîk, kêmkirin û alkîlasyonê wekî ku li jor hatî destnîşan kirin heman bûn, ji bilî ku 2 mg lîzate hate zêdekirin û di reaksiyona klîk de biotin PEG3 azide li şûna biotin azide ya wênesazkirî hate bikar anîn.Piştî dewlemendkirinê, mişk 3 caran bi 5 ml PBS ku %0,2 SDS tê de ye, 3 caran bi 5 ml PBS ku 1 M urea tê de heye, û 3 caran jî bi 5 ml PBS re hatine şûştin.Dûv re, 2 μg trypsin li 300 μl 25 mM ABC ku 1 M urea tê de heye hate zêde kirin da ku proteîn bi şev di 37 °C de bişkîne.Reaksîyon bi lêkirina asîdê formîk hate rawestandin heya ku pHek 2-3 bû.Piştî trîpsinîzasyona li ser mişkan, çareseriya peptîdê bi karanîna stûnek SOLAμ HRP (Thermo, #60209-001) hate şor kirin û di koncentratorek valahiya Speedvac de hişk kirin.Peptîd di 0.1% asîda formîk de ji nû ve hatin hilweşandin û 500 ng peptîd bi karanîna spektrometek girseyî ya Orbitrap Fusion Lumos Tribrid ku bi çavkaniya nano-ESI ya ku li jor hatî destnîşan kirin ve hatî vekolîn kirin.Peptîd li ser pêş stûnên RP-HPLC yên bazirganî (75 μm x 2 cm) (Thermo, no. 164946) û stûnên RP-HPLC analîtîk (75 μm x 25 cm) (Thermo, no. 164941) hatin veqetandin, her du jî bi 2 μm dagirtî.di 60 hûrdeman de gradient ji 8% heya 35% ACN, dûv re bi rêkûpêk di 6 hûrdeman de bi rêjeya herikîna 300 Nl/min bi 98% B zêde bû.Spektrên MS (350-1500 m/z) bi çareseriya 60,000, AGC 4 × 105, û dema têketina herî zêde 50 ms hatin berhev kirin.Îyonên hilbijartî bi rêzê ji hêla HCD-ê ve di 3 semyan de bi enerjiyek lêdana normalkirî ya 30%, pencereyek veqetandina çargoşe ya 1,6 m/z, û çareseriyek 15000 bi dû hev ve hatin perçe kirin. Armancek 5 × 104 tandem spektrometerek girseyî AGC û dema herî zêde ya derzkirinê. ji 22 ms hatin bikaranîn.Dûrxistina dînamîkî li 45 çirkeyan tê danîn. Ji bo MS/MS îyonên nenaskirî an jî yên bi bareya 1+ û >7+ hatine red kirin. Ji bo MS/MS îyonên nenaskirî an jî yên bi bareya 1+ û >7+ hatine red kirin. Nenasînnыe ionы an ionы bi 1+ û >7+ bыli отклонены dlya MS/MS. Ji bo MS/MS îyonên nenaskirî an îyonên bi barkirina 1+ û >7+ hatin red kirin.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Nexazannыe ionы or ionы с зарядами 1+ и >7+ bыli отклонены для МС/МС. Îyon an îyonên nenaskirî yên bi barên 1+ û >7+ ji bo MS/MS hatin red kirin.
Pêngavên amadekirina nimûneyê heya dewlemendkirina berikên NeutrAvidin wekî di analîza LC-MS/MS de ku li jor hatî destnîşan kirin heman bûn.Nêzîkî 50 μg lysate wekî têketinê ji bo kontrolkirina barkirinê û 2 mg lysate ji bo reaksiyonên klîk hate bikar anîn.Piştî zengînkirin û şuştina bi neutravîdîn, proteînên girêdayî bi 50 μl tampon Laemmli's li mêşên rezîna agarozê zêde kirin û di 95°C de 5 hûrdeman kelandin.Ketina barkirina kontrolê û nimûneyên dewlemendkirî yên berikê ji hêla SDS-PAGE ve hatin analîz kirin û bi rêbazên standard Western blot veguheztin membranên PVDF (Millipore, #ISEQ00010).Parzûn bi 5% şîrê kemkirî (Sangon, #A600669) di TBS-ê de ku 0.1% tween-20 (TBST) vedihewîne hatin asteng kirin û bi antîbodên seretayî û duyemîn re li dû hev hatin inkub kirin.Antîbodên seretayî 1:1000 di şîrê 5% ê kêmkirî de di TBST de hatin rijandin û bi şev di 4°C de hatin inkubasyon.Antîkorên duyemîn bi rêjeya 1:5000 hatine bikar anîn û 1 saetê li germahiya odeyê têne înkubakirin.Membran bi karanîna pergala wênekêşiya Chemidoc MP bi kîmyoluminescence ve hatin xuyang kirin.Hemî skanên nebirkirî yên blot û gêl ên di wêneyê de wekî daneyên xav têne pêşkêş kirin.
Antîbozên seretayî yên ku di vê lêkolînê de hatine bikar anîn di nav wan de antîpoşa monoklonal a li dijî-SFPQ kerê (CST, jimar. 71992), antîpota monoklonal antî-FUS (CST, jimar. 67840), antî-NSUN2 antîpoşa poklonal kerê (Proteintech, no. 20854-1-). AP), antîpoşa poklonal a li dij-mSin3A kerê (Abcam, #ab3479), antîpîdê monoklonal antî-taga mişkê (TransGen, #HT201-02), antî-b-aktîn monoklonal mişkî (TransGen, #HC201-01), dij keroşkê. -CDK2 antîbody monoklonal (ABclonal, #A0094), antîbody monoklonal rabbit ji CTBP1 (ABclonal, #A11600), antîbody polyklonal rabbit ji DUT (ABclonal, #A2901), antîbody polyklonal rabbit ji PSMC4 (ABclonal, #A2505 rabbit), Antibody polyclonal DNAJB1 (ABclonal, # A5504).Van antîbodîyan di 1:1000 de di nav şîrê 5% di TBST de hatin bikar anîn.Di vê lêkolînê de antîbodên duyemîn ên ku di vê lêkolînê de hatine bikar anîn IgG-ya dijî-kêr (TransGen, #HS101-01), IgG-ya dij-mişk (TransGen, #HS201-01) di navberek 1:5000 de hene.
Ji bo ku bêtir lêkolîn bikin gelo BRD4 bi SFPQ re têkilî dike, hucreyên HEK293T û BRD4-miniSOG yên stabîl ên ku HEK293T zêde îfade dikin di firaqên 10 cm de hatin rijandin.Hucre bi PBS sar hatin şûştin û di 1 ml pierce IP tampon lîzê (Thermo Fisher, #87787) bi înhîbîtora proteazê ya bê EDTA 30 hûrdeman li 4°C hatin lîz kirin.Piştî wê, lîzat di lûleyên santrîfujê yên 1,5 ml de hatin berhev kirin û di 15,871 xg de ji bo 10 hûrdeman li 4 °C santrîfuj kirin.Spernatant hate berhevkirin û bi 5 μg antî-V5 antî-koklonal a mişkê nîşankirî (CST, #80076) bi şev di 4°C de hate înkubakirin.Nêzîkî 50 µl ji proteîna A/G berikên magnetîkî (MCE, #HY-K0202) du caran bi PBS ku %0,5 Tween-20 heye bişon.Dûv re lîzên şaneyê bi mêşên magnetîkî 4 saetan li 4°C bi zivirandina ji binî ber bi jor ve hatin inkubasyon kirin.Dûv re mişk çar caran bi 1 ml tampon PBST hatin şûştin û 5 hûrdeman di 95°C de hatin kelandin.Nimûne li ser gêlên SDS-PAGE hatin analîz kirin û bi karanîna rêbazên standard Western blot veguheztin membranên PVDF.Parzûn di şîrê 5% di TBST de hatin asteng kirin û bi antîbodên seretayî û duyemîn ve bi rêzê ve hatin înkubakirin.Antîbody antî-SFPQ ya monoklonal antî-SFPQ ya seretayî (CST, #71992) bi rêjeya 1:1000 di 5% şîrê çermkirî de di TBST de hate bikar anîn û di şevekê de li 4 °C hate înkubakirin.Anti-rabbit IgG bi rêjeya 1:5000 hate bikar anîn û 1 saetê li germahiya odeyê hate înkubakirin.Membran bi karanîna pergala wênekêşiya Chemidoc MP bi kîmyoluminescence ve hatin xuyang kirin.
Hemî strukturên ku ji bo analîza Qada Rûyê Gihîdar a Solvent (SASA) têne bikar anîn ji Bankeya Daneyên Proteinê (PDB)52 an Database Structure Protein AlphaFold53 hatine wergirtin.Absolute SASA ji bo her bermayî bi karanîna bernameya FreeSASA hate hesibandin.Tenê daneyên SASA-ya bêkêmasî û nezelal ji bo histidine nîşankirî û cîranên wê ji bo bidestxistina navînî SASA ji bo her avahî hate bikar anîn.Ji bo her hîstidînekê gihîştina helwêstê ya têkildar (RSA) bi dabeşkirina nirxa SASA ya bêkêmasî bi qada rûbera bermayî ya herî zêde ya gengaz a ampîrîkî ya ku ji bo çareserkerê peyda dibe hate hesibandin.Dûv re hemî hîstidîn wekî veşartî hatin dabeş kirin heke navînî RSA di binê 20% de bûya, wekî din xuya bû56.
Pelên xav ên ku di moda DDA-yê de hatine bidestxistin bi karanîna Proteome Discoverer (v2.5) an MSfragger (Fragpipe v15.0) di databasa proteîna pejirandî ya guncan a SwissProt de ku tê de gemarên hevpar tê de hatine lêgerîn kirin.Peptîdên bi du cihên perçebûnê yên wenda, metîlasyona karbamoyl wekî guherandinek rast û oksîdasyona methionine wekî guheztinek dînamîkî hewcedarî trîpsînek bêkêmasî bûn.Toleransên giraniya pêşîn û perçeyê bi rêzdarî 10 ppm û 0.02 Da (MS2 Orbitrap) hatin danîn. Lêdanên gemarî hatin rakirin, û proteîn hatin fîltrekirin da ku rêjeya vedîtina derewîn a <1%. Lêdanên gemarî hatin rakirin, û proteîn hatin fîltrekirin da ku rêjeya vedîtina derewîn a <1%. 1%. Lêdanên gemarê hatin rakirin û proteîn hatin fîltrekirin da ku rêjeya tespîta derewîn a <1%.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1%的错误发现率。 1%. Lêdanên gemarî hatin rakirin û proteîn hatin fîltrekirin da ku rêjeyek erênî ya derewîn bigihîje <1%.Ji bo analîza mîqdar bêyî karanîna nîşanan, naveroka proteîna normalkirî ya ji sê dubareyên biyolojîkî hate bikar anîn.Analîzkirina herêmîkirina binehucreyî ya proteînê bi karanîna analîza Gene Ontolojiya (GO) ji Çavkaniyên Bioinformatics DAVID, MitoCarta 3.0 û databasên ku ji hêla koma Alice Ting ve hatî berhev kirin û weşandin, hate kirin.Nexşeya volqan ji Pirsûsê (v1.6.15.0) hate wergirtin. Guhertinên qatbûna pirbûna proteînê ji bo girîngiya statîstîkî bi karanîna t-testek du alî hatin ceribandin, û lêdanên proteîn bi guherîna pirbûnê >2 (heke wekî din neyê gotin) û nirxa p <0,05 hatin nas kirin. Guhertinên qatbûna pirbûna proteînê ji bo girîngiya statîstîkî bi karanîna t-testek du alî hatin ceribandin, û lêdanên proteîn bi guherîna pirbûnê >2 (heke wekî din neyê gotin) û nirxa p <0,05 hatin nas kirin. Guherandinên kêmasî yên belka были proverenы li ser statîstîkên statîstîkî yên girîng bi karanîna t-krîterên dvustoronnego, û sovpadeniya belkov bыli identificirovanы guherbarên biderzaniya 2 (esli 5 ne girîng e) Guhertinên qat bi naveroka proteînê ji bo girîngiya statîstîkî bi karanîna t-testek du-piştî hatin ceribandin, û hevrêzên proteîn bi guherîna naverokê >2 (heke wekî din neyê destnîşan kirin) û nirxa ap <0.05 hatin nas kirin.使用使用双边 检验双边 检验检验蛋白质 倍数倍数 的 统计 显着性, 并 确定 蛋白质 命 中 的 丰度 丰度> 2 (除非 另 有 说明) 和 P 值 <0.05.使用使用双边 检验双边 检验检验 检验倍测试的统计 显着性显着性 确定确定的 显着性 并 确定 变化 命 中 的 丰度 变化> 2 (另 有 说明) 和 P 值 <0.05. Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли со отользованием двустороннего t-kriteriya, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иноей <0, и p. Girîngiya statîstîkî ya guhertinên qat di naveroka proteînê de bi karanîna t-testek du-piştî hate ceribandin, û hevrêzên proteîn ji bo guhertinên naverokê >2 (heke wekî din neyê destnîşan kirin) û p-nirxên <0,05 hatin destnîşankirin.Analîzkirina pêwendiya proteînê bi karanîna analîza GO re digel databasa String hate kirin.
Sê dubareyên biyolojîkî bi encamên heman rengî hatin kirin.Analîza statîstîkî bi GraphPad Prism (nermalava GraphPad) hate kirin û bi Perseus (v1.6.15.0) nexşeyên volqan hatin çêkirin.Ji bo berhevdana her du koman, nirxên p-ê bi karanîna testa T-ya Xwendekarê ya du-deng hatine destnîşankirin.Tenê proteînên singleton ên ku bi kêmî ve du caran di koma ceribandinê de hatine nas kirin di nexşeyên volqan de hatine girtin, û nirxên têkildar ên winda yên di koma kontrolê de ji dabeşek normal bi Perseus hatine veguheztin da ku nirxa p-yê were hesibandin.Barên çewtiyê navînî ± veqetandina standard nîşan didin.Di analîzên proteomîk ên ji bo analîzên statîstîkî de, pirbûna proteînên ku bi kêmî ve di du dubareyên biyolojîkî de xuya bûn de hate girtin.Rêbazên îstatîstîkî nehatin bikar anîn da ku pîvana nimûneyê ji berê ve were destnîşankirin.Ceribandin ne tesadufî ne.Lêkolîner di dema ceribandin û nirxandina encaman de ji peywiran kor nebûn.
Ji bo bêtir agahdarî li ser sêwirana lêkolînê, li Rapora Lêkolîna Xwezayê ya ku bi vê gotarê ve girêdayî ye binêre.
Daneyên spektrometrîya girseyî yên ku di vê lêkolînê de hatine bidestxistin, bi navgîniya depoya hevkarê iProX57 di bin ID PXD034811 (danûstandinên PDPL-MS) de ji Konsorsiyuma ProteomeXchange re hate şandin.Daneyên xav di forma pelên daneya xav de têne peyda kirin.Ev gotar daneyên orîjînal peyda dike.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Naskirina cîranê: bikaranîna biotinylasyonê-girêdayî nêzîkbûnê ji bo taybetmendiya kompleksên proteîn û organelên nexşeyê. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Naskirina cîranê: bikaranîna biotinylasyonê-girêdayî nêzîkbûnê ji bo taybetmendiya kompleksên proteîn û organelên nexşeyê.Gingras, AS, Abe, KT û Raut, B. Nasbûna bi derdorê re: karanîna biotinîlasyona-girêdayî nêzîkbûnê ji bo karakterîzekirina kompleksên proteîn û organelên nexşeyê. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. 了解邻里：使用邻近依赖性生物素化来表征蛋白质复合物用邻近依赖性生物素化来表征蛋白质复合物徶 Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Fêmkirina cîranê: girêdayîbûna taxê bi jiyana biyolojîkî re bikar bînin.Gingras, AS, Abe, KT û Raut, B. Fêmkirina nêzîkbûnê: taybetmendîkirina kompleksên proteîn û nexşeya organelan bi karanîna biotinîlasyona girêdayî nêzîkbûnê.Vêga.Raya min.Şîmyawî.biyolojî 48, 44–54 (2019).
Gerî, JB et al.Nexşeya mîkro hawîrdorê bi veguheztina enerjiya Dexter li hucreyên parastinê.Zanist 367, 1091–1097 (2020).
Hertling, EL et al.Torên pîvana du-proteome nûvekirina hucre-taybetî ya pêwendiya mirovî tespît dikin.Cells 184, 3022–3040.e3028 (2021).