Spas ji bo serdana Nature.com.Guhertoya geroka ku hûn bikar tînin piştgirîya CSS-ê sînordar e.Ji bo ezmûna çêtirîn, em pêşniyar dikin ku hûn gerokek nûvekirî bikar bînin (an jî Moda Lihevhatinê ya di Internet Explorer de neçalak bikin).Di vê navberê de, ji bo misogerkirina piştgirîya domdar, em ê malperê bê şêwaz û JavaScript pêşkêş bikin.
Hucreyên penceşêrê mekanîzmayên cihêreng pêş xistine da ku stresa hucreyî derbas bikin û pêşkeftinê bidomînin.Protein kinase R (PKR) û aktîvatora proteîna wê (PACT) bersivkerên destpêkê ne ku nîşanên stresê yên cihêreng dişopînin ku rê li ber astengkirina belavbûna hucreyê û apoptozê digirin.Lêbelê, rêziknameya rêça PACT-PKR di hucreyên penceşêrê de bi piranî nenas dimîne.Li vir, me dît ku RNA-ya ne-kodkirî ya dirêj (lncRNA) aspartyl tRNA synthetase antîsense RNA 1 (DARS-AS1) rasterast di astengkirina rêça PACT-PKR de têkildar e û belavbûna hucreya penceşêrê pêşve dike.Bi karanîna pîvandina fonksiyonê ya mezin a lncRNA-ya CRISPRi 971-a-girêdayî penceşêrê, me dît ku DARS-AS1 bi berfirehbûna hucreyên penceşêrê re têkildar bû.Ji ber vê yekê, DARS-AS1 knockout pirbûna hucreyê asteng dike û apoptoza hucreya penceşêrê di xêzên hucreyên kanserê yên cihêreng de di vitro de pêşve dike û bi girîngî mezinbûna tumorê di vivo de kêm dike.Ji hêla mekanîkî ve, DARS-AS1 rasterast bi qada aktîvkirina PACT-ê ve girêdide û pêşî li pêwendiya PACT-PKR digire, bi vî rengî çalakkirina PKR, fosforîlasyona eIF2α, û mirina hucreya apoptotîk kêm dike.Ji hêla klînîkî ve, DARS-AS1 bi gelemperî di gelek penceşêrê de tête diyar kirin, û zêdederxistina vê lncRNA nîşana pêşgotinek nebaş e.Ev lêkolîn rêziknameya taybetî ya penceşêrê ya rêça PACT-PKR-ê ji hêla DARS-AS1 lncRNA ve diyar dike û ji bo pêşgotin û dermankirina penceşêrê armancek din peyda dike.
Kapasîteya adaptasyona stresê taybetmendiyek girîng a zindîbûn û belavbûna hucreyên kanserê ye.Berbelavbûna bilez û nîşaneyên metabolîk ên penceşêrê di mîkro hawîrdorên hişk de - kêmbûna xurek, hîpoksî, û pH-ya nizm - ku dikare rêyên îşaretkirina mirina hucreyê bişopîne, digihîje lûtkeyê.Nerêkûpêkkirina genên hestiyar ên stresê yên wekî p535, proteînên şoka germê 6, 7, KRAS8, 9, û HIF-110, 11, 12, 13 bi gelemperî di penceşêrê de têne dîtin, bi vî rengî apoptosis asteng dike û zindîbûnê pêşve dike.
Protein kinase R (PKR) senzorek stresê ya girîng û yekîneya kinase ya faktora destpêkirina eukaryotî 2α (eIF2α) ye, regulatorek wergêr ku stresa hucreyî bi mirina hucreyê ve girêdide.PKR di destpêkê de wekî proteînek antiviral ji hêla vedîtina RNA-yek dubendî ya biyanî (dsRNA) ve hate nas kirin.Li ser çalakkirinê, PKR eIF2α fosforîlate dike da ku senteza proteîna vîrus û hucreyî asteng bike14,15,16.PACT (proteîna aktîvator PKR) di nebûna dsRNA17,18,19,20,21,22,23 de wekî yekem proteîna aktîvator PKR hate nas kirin.Bi danûstendina rasterast a bi PKR re, PACT stresên cihêreng (birçîbûna serumê, dermankirina peroksît an arsenît) vediguhezîne PKR û rêyên nîşankirina jêrîn.Digel fosforîlasyona eIF2α, aktîvkirina PKR-ya PACT-ê bi navbeynkariya PACT bûyerên cûrbecûr yên ku bi bersiva stresê ve girêdayî ne, di nav de guheztina rewşa redox bi riya riya PI3K / Akt24, kontrolkirina zirara DNA ya bi navgîniya p5325,26 û NF-κB27,28 veguheztinê rê dide, 29. Ji ber rola wan a krîtîk di bersiva stresê, belavbûn, apoptosis û pêvajoyên din ên hucreyî yên sereke de, PKR û PACT ji bo gelek nexweşiyan, nemaze penceşêrê, armancên dermankirinê sozdar in30,31,32,33.Lêbelê, tevî vê girîngiya fonksiyonel û biyolojîk a pleiotropîk, rêziknameya çalakiya PACT / PKR di hucreyên kanserê de neçar dimîne.
lncRNA transkriptên ji 200 nukleotîdan mezintir in ku potansiyela kodkirina proteînan tune.Ji ber ku projeyên rêzgirtina tevheviya genomê ya pêşkeftî bi hezaran lncRNAs nas kirine, 35,36 gelek hewldan hatine kirin ku fonksiyonên wan ên biyolojîk ronî bikin.Lêkolînek mezin nîşan dide ku lncRNA di gelek pêvajoyên biyolojîkî de37, di nav de rêziknameya neçalakkirina kromozoma X38,39, çapkirin40, transkrîpsiyona41,42, werger43 û tewra mezinbûna penceşêrê44,45,46,47 jî heye.Van lêkolînan ragihandin ku gelek lncRNA di riya PACT/PKR de beşdar in.Lêkolînek weha destnîşan kir ku lncRNA ASPACT veguheztina PACT asteng kir û ragirtina nukleer a PACT mRNA zêde kir.Lêkolînên din destnîşan kirin ku lncRNA nc886 bi PKR ve girêdide û fosforîlasyona wê asteng dike49,50.Heya nuha, lncRNA ku aktîvkirina PKR-ya navbeynkariya PACT-ê rêve dike nehatiye ragihandin.
Aspartyl-tRNA synthetase antîsense RNA 1 (DARS-AS1) wekî lncRNA51,52,53,54 onkojenîk hatiye nasîn.Bi rêziknameya miP-194-5p53, miP-12952 û miP-532-3p51, DARS-AS1 hate destnîşan kirin ku bi rêzdarî mezinbûna kansera hucreya gurçikê ya hucreya zelal, kansera tîroîdê û kansera pişikê ya ne-biçûk pêşve dike.Tong û hevkarên wî her weha dîtin ku DARS-AS1 pêşveçûna myeloma bi domandina aramiya proteîna 39 (RBM39) motîfa girêdana RNA pêşve dike.Lêbelê, ti lêkolîn nehatine kirin ka gelo ev lncRNA di rêziknameya aktîvkirina PACT-PKR û bersiva stresê ya hucreyên penceşêrê de têkildar e.
Li vir, me bi karanîna pergala CRISPRi ekranek windabûna fonksiyonê ya mezin pêk anî û destnîşan kir ku DARS-AS1 lncRNA belavbûna çend celeb hucreyên penceşêrê pêşve dike.Wekî din, me mekanîzmayek sereke destnîşan kir: DARS-AS1 rasterast bi PACT-ê ve girêdide, girêdana PACT û PKR asteng dike, pêşî li fosforîlasyona eIF2α, substratek PKR-ya jêrîn digire, û di dawiyê de mirina hucreya apoptotîk asteng dike.Di encamê de, xebata me DARS-AS1 lncRNA wekî rêgezek rêça PACT-PKR û armancek potansiyel ji bo dermankirin û pêşbîniya penceşêrê eşkere dike.
Berfireh lêkolînên profîla genomîk bi sedan lncRNAs bi penceşêrê re têkildar in.Lêbelê, fonksiyona wan bi gelemperî nenas dimîne56.Ji bo naskirina berendamên lncRNA yên sozdar ên ku di pêşkeftina penceşêrê de beşdar in, me ji bo kêmbûna belavbûna di xeta şaneya kansera kolorektal a SW620 de bi karanîna pergala CRISPRi ve ekranek winda-karsaziyê pêk anî (Hêjî. 1a).Taybetmendiya bêhempa ya xetên hucreyên kansera kolonê SW480 û SW620 ev e ku ew di nexweşek yek de ji tumorên seretayî û duyemîn têne derxistin.Ev berhevokek hêja ji bo xwendina guheztinên genetîkî di pêşveçûna kansera kolonê ya pêşkeftî de peyda dike.Ji ber vê yekê, me transkrîptomên xêzên şaneyên penceşêrê yên kolorektal (SW480 û SW620) bi karanîna rêzgirtina RNA analîz kirin û hin lncRNAyên fonksiyonel ên potansiyel ji wêjeya çapkirî berhev kirin.Li ser bingeha van encaman, me pirtûkxaneyek sgRNA ya hevgirtî ya ku tê de 7355 oligoyên sgRNA hene ku 971 lncRNA-yên girêdayî penceşêrê û 500 oligoyên sgRNA yên nehedefkirî ji bo kontrolek neyînî (Daneyên Pêvek 1) dikin armanc.
Nûneratiya şematîkî ya verastkirinê bi karanîna pergala CRISPRi.zengînkirina b sgRNA piştî kontrolkirinê.Xeta xalîçeya horizontî log2 (guhertina qat) = ±0.58 temsîl dike.Xeta xalîçeya vertîkal nirxa p = 0,05 nîşan dide.Xalên reş sgRNA-ya ne-armanc (wekî NC-ê hatî destnîşankirin) temsîl dikin.Xalên sor sgRNA ne ku DARS-AS1 hedef digirin.Xalên şîn sgRNA ne ku LINC00205, lncRNA-ya onkojenîk a ku berê hatî destnîşan kirin armanc dikin.guhertina qat = (xwendina normalîzekirî, roja 17)/(xwendina normalîzekirî, roja 0).c Knockdown DARS-AS1 sgRNA mezinbûna hucreyê asteng kir.Barên çewtiyê ± veqetandina standard a sê ceribandinan nîşan dide.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 T-testa xwendekaran a dualî.d îfadeya DARS-AS1 di tumoran de (danûstandina TCGA).Em Vebijandina DARS-AS1 di nimûneyên normal û tumor ên hevbeş de ji nexweşên bi BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP, û COAD, bi rêzê ve (danûstandinên TCGA).P-nirx bi karanîna testa T-ya Xwendekarê ya du-du-hev ve hatine wergirtin.
Piştî avakirina plasmîdê û pakkirina lentivirus, me di çar ceribandinên enfeksiyonê yên serbixwe de xeta şaneya kansera kolorektal dCas9-SW620 bi pirtûkxaneya jorîn veguhezand.Pirbûna enfeksiyonê (MOI) ji bo van enfeksiyonan 0.1-0.3 bû, ku destnîşan dike ku her şaneyek tenê bi yek sgRNA dikare were veguheztin.Piştî 18 rojên çanda in vitro, profîla dewlemendkirina sgRNA-yên armanc piştî ceribandinê kêm bû an zêde bû, di heman demê de hejmara oligonukleotîdên kontrolê yên ne-armanc li gorî profîla pêş-pîşandanê bi rengekî neguhêrbar ma, ev destnîşan dike ku armanca me xwedan ekranek pir taybetî ye. pirtûkxane.Birinc.1b û tabloya pêvek 1). LINC00205, ku berê hatibû ragihandin ku pêşkeftina kansera pişikê û kansera kezebê pêşve dike58,59,60, hate ceribandin (log2 (guhartina qat) < -0,58, nirxa p <0,05), pêbaweriya vê vekolînê piştrast dike (Hêjî. 1b). LINC00205, ku berê hatibû ragihandin ku pêşkeftina kansera pişikê û kansera kezebê pêşve dike58,59,60, hate ceribandin (log2 (guhartina qat) < -0,58, nirxa p <0,05), pêbaweriya vê vekolînê piştrast dike (Hêjî. 1b). LINC00205, an kotorom ranee soobщalosь, что он способствует прогрессированию рис леких и для для печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, верность0 значај p<0, . 1b). LINC00205, ku berê hatibû ragihandin ku pêşveçûna penceşêra pişikê û kansera kezebê pêşve dike58,59,60, hate derxistin (log2 (guhartina qat) <-0,58, p-nirx <0,05), bihêzbûna vê ceribandinê piştrast dike (Hêjî. .1b) . Linc00205 之前 被 报道 可 促进 肺癌 肺癌 和 促进 58,59,60, 被 筛 选 掉 (Log2 (倍数倍数) <-0.58, p 值 <0.05), 证实 了 该 筛选 的 可靠性 (图 1b). Linc00205 之前 被 报道 可 促进 肺癌 肺癌 和 促进 58,59,60, 被 筛 选 掉 (Log2 (倍数倍数) <-0.58, p 值 <0.05), 证实 了 该 筛选 的 可靠性 (图 1b). LINC00205, an kotorom ranee soобщалось, что он способствует огромно овозможување на hêmanên hênik û peçeni58, 59, 60, был исключен (log2 (kurtnoe изменение) <-0,58, p-значание <0, . 1b). LINC00205, berê hate ragihandin ku pêşveçûna kansera pişikê û kezebê pêşve dike58,59,60, hate derxistin (log2 (guhartina qat) <-0,58, p-nirx <0,05), bihêzbûna vê vekolînê piştrast dike (Hêjî. .1b).
Di nav hemî lncRNAyên hatine ceribandin de, DARS-AS1 jî hate pêşandan, bi sê oligonukleotîdên sgRNA yên hevnas piştî 18 rojên çandê bi girîngî kêm bûn, û destnîşan kir ku têkbirina vê lncRNA dibe sedema kêmbûna belavbûna penceşêrê (Wêne. 1b).Ev encam ji hêla analîza MTS-ê ve di hucreyên penceşêrê yên kolorektal de bêtir hate piştgirî kirin ku nîşan dide ku rêjeya mezinbûna şaneyên têkbirina DARS-AS1 li gorî şaneyên kontrolê tenê nîvî bûye (Wêne 1c) û bi raporên berê yên çend celebên din ên penceşêrê re hevaheng bû.: kansera gurçikê ya şaneya zelal, kansera tîroîdê û kansera pişikê ya xaneyên nebiçûk51,52,53,55.Lêbelê, fonksiyon û mekanîzmayên molekularî yên di kansera kolorektal de nehatine vekolîn dimîne.Ji ber vê yekê, me ev lncRNA ji bo lêkolînek bêtir hilbijart.
Ji bo lêkolîna îfadeya DARS-AS1 li nexweşan, me 10,327 nimûneyên tumorê ji projeya Genome Atlas (TCGA) bi berfirehî analîz kirin.Encamên me destnîşan dikin ku DARS-AS1 di nav cûrbecûr tumoran de, di nav de adenocarcinoma kolonê (COAD), kansera hucreya zelal a gurçikê (KIRC), û kansera hucreya papîlar a gurçikê (KIRP) di nav hucreyên saxlem de bi berfirehî tê xuyang kirin û bi girîngî tê verast kirin..Pir hindik (Hêjîra 1d û Pêvek. 1a, b). Analîza nimûneyên saxlem/tumorî yên bi hev re bêtir eşkerebûnek girîng a DARS-AS1 di tumorên kansera mîzdankê de (BLCA), kansera hucreya zelal a gurçikê (KIRC), adenokarsinoma prostatê (PRAD), kansera hucreya squamous a pişikê (LUSC) de piştrast kir. , kansera endometrial a korpusê malzarokê (UCEC), adenokarsinoma pişikê (LUAD), kansera kezebê ya kezebê (LIHC), kansera hucreya papîlar a gurçikê (KIRP), û adenokarsinoma kolonê (COAD) (nirxa p <0,05) (Hêl. 1e–m) . Analîza nimûneyên saxlem/tumorî yên bi hev re bêtir eşkerebûnek girîng a DARS-AS1 di tumorên kansera mîzdankê de (BLCA), kansera hucreya zelal a gurçikê (KIRC), adenokarsinoma prostatê (PRAD), kansera hucreya squamous a pişikê (LUSC) de piştrast kir. , kansera endometrial a korpusê malzarokê (UCEC), adenokarsinoma pişikê (LUAD), kansera kezebê ya kezebê (LIHC), kansera hucreya papîlar a gurçikê (KIRP), û adenokarsinoma kolonê (COAD) (nirxa p <0,05) (Hêl. 1e–m) .Analîza nimûneyên saxlem/tumorî yên bi hev re di heman demê de îfadeya girîng a DARS-AS1 di kansera urotelîal a mîzê de (BLCA), kansera hucreya hucreya gurçikê û gurçikê (KIRC), adenokarcinoma prostatê (PRAD), tumorên kansera hucreya squamous ya pişikê (LUSC) de bi girîngî zêde eşkere kir., karcinoma endometrîya tela matîk (UCEC), adenokarcinoma legkogo (LUAD), gepatocellulyarnaya karcinoma peçenî (LIHC), papillyarno-kletotîka karcinoma pockî (KIRP) û adenokarcinoma tolstoAD) (0) (0) mê) . , kansera endometrial ya korpus uterî (UCEC), adenokarcinoma pişikê (LUAD), kansera kezebê ya kezebê (LIHC), kansera hucreya papillary ya gurçikê (KIRP), û adenokarcinoma kolonê (COAD) (p nirx 0,05) (Hêjîrê 1e– m) .配对配对 / 肿瘤样本 的 分析 进一步 证实 了 dars-as1 在 膀胱 尿路 上 皮癌 (Blca), 肾肾肾 细胞癌 (kirc), 前列 腺腺癌 (Prad), 肺鳞状 细胞癌 (Lusc) 肿瘤 中显着 更 高 表达, 子宫体子宫 内膜 癌 (UCEC), 肺腺癌 (Luad), 肝肝 细胞癌 (lihc), 肾 肾肾 (kirp) 和结肠腺癌 (coad) (p 值<0.05）(图1e-m) .配 对 健康 / 肿瘤样本 的 分析 证实 了 dars-os1 在 尿路尿路 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌, 肾 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 前列 腺腺癌 腺腺癌 细胞癌 细胞癌 前列 腺腺癌 腺腺癌 (prad), 细胞癌细胞癌(Lusc) 肿瘤 的 的 的 的 中 中 中 中中 中中 中中 中中 中中 更更 高 表达高, 内膜 癌 显着 高 表达, 内膜 癌 ((Ucel) 肝肝 细胞癌 (LUAD) 肝肝 细胞癌 (LHC) 肾 肾 乳头状癌 (kirp) (coad) (p 值<0.05) (图1e-m) .Analîzên nimûneyên bi tendurist / tîmorî yên bi hev ve girêdayî rola DARS-AS1 di kansera mîzdankê de (BLCA), kansera hucreya gurçikê ya hucreya zelal (KIRC), adenokarcinoma prostatê (PRAD), û kansera hucreya squamous ya pişikê (LUSC) de bêtir piştgirî kir.эkspressiya bi karcinoma tela matîkê (UCEC), adenokarsinome legkogo (LUAD), gepatocellulyarnoy karcinoma (LIHC), poчечно-почечной папиллярно-клеточной карцином (KIRP) û adenokarsinome legkogo (LUAD) (tolsto) -m). îfadeya di kansera zikmakî (UCEC), adenokarsinoma pişikê (LUAD), kansera hepatocellular (LIHC), kansera hucreya papîlar a gurçikê (KIRP), û adenokarsinoma kolonê (COAD) (nirxa p <0,05) (Wêne 1e -m).Bi hev re, ev encam destnîşan dikin ku DARS-AS1 di cûrbecûr penceşêrê de bi berfirehî û pir zêde tête diyar kirin.
Ji ber ku DARS-AS1 û DARS (genê ku xêza antîsensê kod dike) heman promotorê parve dikin û li kêleka hev in, me shRNA çêkir da ku bi taybetî DARS-AS1 têk bibe lê ne DARS (Hêjmara Pêvek. 2a,b û Tabloya Pêvek 2) .Ji bilî SW620, me sê xetên hucreyên din ên ku DARS-AS1 pir eşkere dikin jî bikar anîn da ku bandor û fonksiyona têkbirina shRNA lêkolîn bikin (Tabloya Pêvek 3).Encamên me destnîşan kirin ku her sê shRNAyên pêşkeftî bi kêmî ve %80 karîgerîya têkbirina DARS-AS1 bi hindik bandorek li ser mîqdara mRNA ya DARS bi dest xistin (Hêjmara Pêvek. 2c–f).Wekî din, me dît ku têkçûna DARS-AS1 bi van shRNAyan re bi girîngî mezinbûna hucreyê di xetên hucreyên kansera kolorektal de SW620 (49.7%) û HCT116 (27.7%), rêza hucreya kansera pêsîrê MBA-MD-231 (53.4%) asteng kir.) û xeta şaneya hepatoma ya HepG2 (92,7% kêmkirina), û her weha şiyana wan a avakirina qadên bêserûber (kêmkirina navînî ~ 50,8%, 44,6%, 40,7% û 75,7% ji her xêzek şaneyê) (Hêjî. 2a,b).Di SW620 de, encamên ceribandina damezrandina koloniyê bêtir piştrast kir ku DARS-AS1 shRNA bi kêmbûna navînî bi qasî 69,6% bi girîngî zêdebûna hucreyê asteng dike (Hêjî. 2c).
Bandora kontrolkirina shRNA û DARS-AS1 shRNA li ser belavbûna hucreyê (a) û damezrandina spheroid (b) di hucreyên SW620, HCT116, MBA-MD-231, û HepG2 de.c Bandora kontrolkirina shRNA û DARS-AS1 shRNA li ser damezrandina koloniyê di hucreyên SW620 de.Zêdebûna hucreyê (d), avakirina sferoidê (e), û avakirina koloniyê (f) ya hucreyên SW620 ku DARS-AS1 zêde îfade dikin.Daneyên ku têne xuyang kirin navînî ± veqetandina standard a sê ceribandinan in.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, û *** p ≤ 0,001 ji hêla T-testa Xwendekarê ya du-deng ve.
Ji bo temamkirina lêkolînên windakirina fonksiyonê, me dûv re şaneyên SW620 ku DARS-AS1 zêde derdixin afirandin (Hêjîra Pêvek. 2g).Zêdebûna DARS-AS1 di şaneyên SW620 de mezinbûna hucreyê (1,8 qat), avakirina sferoîdê ya bêserûber (1,4 qat), û avakirina koloniyê (3,3 qat) bi girîngî zêde kir (Hêjî. 2d–f).Me ev encam bi karanîna hucreyek din a DARS-AS1, A549, piştrast kir.Ev zêdebûna hucreyê ya ji ber zêdebûna DARS-AS1 di hucreyên A549 de bêtir hate dîtin (Hêjmara Pêvek. 2h, i û Tabloya Pêvek 3).Bi hev re, van lêkolînên destkeftî û windabûnê destnîşan dikin ku DARS-AS1 belavbûna hucreyên penceşêrê li vitro pêşve dike.
Ji bo vekolîna mekanîzmaya bingehîn a ku DARS-AS1 pirbûna hucreyê bi rêkûpêk dike, me analîzek dakêşana RNA-yê kir da ku hevkarên wê yên potansiyel-girêdana proteîn nas bikin.Encamên RT-qPCR destnîşan kirin ku bi qasî 86,2% DARS-AS1 di sîtoplazmaya şaneyên SW620 de cih digire (Hêjmara Pêvek. 3a).Dûv re DARS-AS1 an pseudoRNA biotinylated transkripted in vitro bi lîzatên hucreya SW620 ve hate veqetandin û dûv re veqetandina SDS-PAGE.Pîvana zîvê ya paşerojê nîşan da ku bendek cihêreng (~ 38 kDa) di nimûneyên kişandina DARS-AS1 de bi girîngî dewlemend bûye lê ne di nimûneyên ARN-ê an mêşan de (Hêjî. 3a).Ev band wekî proteînek çalakker a PKR (PACT) ji hêla spektrometrîya girseyî (MS) ve hate nas kirin û bêtir ji hêla immunoblottingê ve di xetên hucreyên SW620, HCT116, û HepG2 de hate pejirandin (Hêjî. 3a,b).Dewlemendkirina DARS û proteînên PACT yên têkildar - PKR û TRBP - di heman demê de bi karanîna analîza RNA ji hêla Western blotting (WB) ve hate lêkolîn kirin.Encaman destnîşan kir ku di navbera DARS-AS1 RNA û van her sê proteînan de ti têkiliyek rasterast nehat dîtin (Hêjmara Pêvek. 3b).Têkiliya taybetî ya di navbera DARS-AS1 û PACT de bêtir ji hêla analîzkirina RNA immunoprecipitation (RIP) ve hate pejirandin, ku destnîşan kir ku DARS-AS1 di antî-PACT-ê de bi girîngî dewlemend bû lê ne RNA-yên din ên kontrolê (Wêne 3c).Ji bo destnîşankirina ka DARS-AS1 rasterast bi PACT-ê re di nebûna hêmanên hucreyî yên din de têkilî dike, bi karanîna PACT-a paqijkirî ve ceribandinek interferometrîya biyolaya in vitro (BLI) hate kirin.DARS-AS1 an jî RNA-ya dummy ya bi biotin nîşankirî li ser biyosensorên streptavidîn (SA) hate bêbandorkirin û dûv re di tamponek kînetîk a ku 1 μM PACT tê de ye hate înkubakirin.Nemaze, PACT bi DARS-AS1 (nirxa KD ~ 26.9 nM) bi hêz ve girêdayî ye, lê ne bi ARN-ê ve girêdayî ye (Wêne 3d).Bi hev re, ev encam di navbera DARS-AS1 û PACT de têkiliyek rasterast û têkiliyek bilind destnîşan dikin.
Analîza kişandina RNA destnîşan kir ku DARS-AS1 di hucreyên SW620 de bi PACT re têkildar e.Li jor, rengkirina zîv a proteînên têkildar.Immunoblots kêmtir bi antî-PACT antî-PACT pêk hat.b Analîzkirina vekêşana RNA di şaneyên HCT116 (jor) û HepG2 (jêr) de hate kirin.Dewlemendkirina PACT bi immunoblottingê hate tespît kirin.Vekolînên immunoprecipitation (RIP) cRNA di hucreyên SW620 de bi karanîna antîbodên destnîşankirî hatin kirin.d Kevirên girêdana PACT-ê bi DARS-AS1-a tev-dirêj an RNA-ya kontrolê bi karanîna interferometriya biyolayer (BLI) hatin wergirtin.ARN li ser biyosensorek streptavîdîn hate bêbandorkirin.Ji bo pîvandina hevgirtinê 1 μM PACT hate bikar anîn.Vekolîna kişandina ARN-ê bi karanîna DARS-AS1-a dirêj-biyotinylated an qutkirî (jor) hate kirin.Immunoblot nîşan dide ku PACT hatî wergirtin (jêr).f PACT-a ala pakkirî ya paqijkirî bi DARS-AS1-a dirêj-biyotinylated an jî qutkirî (wek e) ji bo ceribandina RIP ya in vitro hate înkubakirin.RNA-ya ku hatî derxistin ji hêla RT-qPCR ve hate verast kirin.g Têkiliya têkildar a perçeyên RNA yên cihêreng ên ji bo PACT-ê bi karanîna interferometriya biyolojîk ve hate bidestxistin.Ji bo analîzê, 100 nM RNA û 1 μM RAST hatin bikar anîn.h Vekolînên RIP-ê yên in vitro bi karanîna PACT-a binavkirî ya safîkirî an qutkirî hatine kirin.RNA-ya ku hatî derxistin ji hêla RT-qPCR ve hate verast kirin.i Rêjeya mezinbûnê ya hucreyên SW620 ku DARS-AS1, PACT, an jî herduyan zêde îfade dikin.j Zêde îfadekirina DARS-AS1-a tev-dirêj an qutkirî di hucreyên SW620 de bandorên cûda li ser mezinbûna hucreyê hebû.k Apoptosis bi immunoblotting bi antî-PARP antîpoş hate tesbît kirin.l Knockout of DARS-AS1 apoptoza hucreyên SW620 wekî ku ji hêla sîtometrîya herikînê ve hatî destnîşan kirin çêdike.Daneyên ku têne xuyang kirin navînî ± veqetandina standard a sê ceribandinan in. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, bi îmtîhana t-yê ya xwendekar a du dûvik. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, bi îmtîhana t-yê ya xwendekar a du dûvik. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 ji hêla T-testa Xwendekarê ya du-dualî ve. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 ji hêla T-testa Xwendekarê ya du-dualî ve.
Dûv re me sê perçeyên DARS-AS1 RNA yên biotinylated bi veguheztina in vitro çêkir da ku herêma DARS-AS1 ya ku ji bo komeleya PACT hewce dike nas bike (Wêne 3e).Encamên analîza RNAyê nîşan da ku her perçeyek karibe bi PACT-ê re têkilî dayne, lê devera 3'-termînalê (384-768 nukleotîdên bi nîşana A3) zêdetirî 1-384 nukleotîdên bi nîşana A1 nîşan didin (Hêl. 3e).Encamên bi vî rengî di ceribandina RIP-ê ya in vitro de bi karanîna PACT-a recombinant ve hatin dîtin (Wêne 3f).Bi van encaman re hevaheng, ceribandinên girêdana perçeyên RNA yên bêbandorkirî bi PACT-ê re bi karanîna BLI jî destnîşan kir ku PACT ji A3 (384-768 nt) (nirxa KD ya bi qasî 94,6 nM) re têkiliyek bilindtir e, di heman demê de ku hema bêje bi deverên din re têkildar nîne.(Hêjîra 3d).
Me di PACT-ê de herêmên girêdayî girêdayî jî lêkolîn kir.PACT sê domên fonksiyonel dihewîne, du ji wan domên girêdana RNA-ya du-bendî (dsRBD) û domînek sêyemîn (D3 hatî destnîşan kirin) ku wekî aktîvatorek danûstendinên proteînê tevdigere.Ji bo vekolîna kapasîteya girêdana lncRNA ya her domainê, me sê mutasyonên ku her sê doman jêbirin û ceribandinek RIP a in vitro pêk anîn.Encamên me destnîşan kirin ku jêbirina qada sêyemîn (D3) ya PACT-ê bi DARS-AS1-ê re (bi 0,11 qat li gorî PACT-ya saxlem) li gorî her du mutasyonên din (Wêne. 3h) bi girîngî danûstendina wê kêm kir, hate destnîşan kirin ku berdan ya D3 bi DARS re têkilî danî.-AC1.Bi hev re, ev encam destnîşan dikin ku pêwendiya di navbera DARS-AS1 û PACT de dibe ku di serî de bi dawiya 3 'dawiya DARS-AS1 û qada D3 ya PACT pêk were.
Me destnîşan kir ku DARS-AS1 tu bandorek li ser derbirîna PACT-ê û PACT li ser DARS-AS1 tune bû (Hêjmara Pêvek. 3c).Dûv re me bandora hilweşîna PACT li ser mezinbûna hucreyê lêkolîn kir.Berevajî DARS-AS1, dema ku PACT hate hilweşandin, şaneyên têkildar 1,5-3 qat zûtir mezin bûn (Hêjmara Pêvek. 3d).Encamên ceribandina avakirina koloniyê destnîşan kir ku şaneyan piştî dermankirina shRNA ya bi PACT re 2-3 qat kolonî ava kirin (Hêjmara Pêvek. 3e).Ji bo ceribandina ka DARS-AS1 bi PACT ve belavbûna hucreyê bi rê ve dibe, me hucreyên SW620 yên ku PACT, DARS-AS1, an her du zêde îfade dikin, hilberandin.Zêdebûna PACT-ê astengiyek girîng a pirbûna hucreyê nîşan da (Wêne 3i).Dema ku DARS-AS1 zêde îfadekirina bi serê xwe bi girîngî zêdekirina hucreyê pêşve xist, di rêjeya mezinbûna hucreyên ku DARS-AS1 û PACT zêde îfade dikin de cûdahiyek girîng tune.Van encaman destnîşan dikin ku PACT dibe ku li hember zêdebûna belavbûna ku ji hêla DARS-AS1-a zêde derbirînê ve hatî çêkirin berteref bike.
Ji ber ku herêmên cihêreng ên DARS-AS1 xwedan şiyanên girêdana PACT-ê yên cihê ne, me bandora wan a têkildar li ser pirbûna hucreyê bi vegotina cûda ya perçeyên DARS-AS1 vekolîn.Li gorî her du perçeyên din, DARS-AS1 li dawiya 3' (384-768 nt), devera sereke ya girêdayî PACT-ê di DARS-AS1 de, ku xwedan şiyana herî bilind bû ku mezinbûna hucreyê teşwîq bike, zêde hate eşkere kirin (Wêne. 3j).Van encaman têkiliyek erênî di navbera kapasîteya girêdanê û fonksiyona biyolojîkî ya DARS-AS1 de destnîşan dikin.
PACT hate ragihandin ku proteînek pro-apoptotîk e19.Ji ber vê yekê, me bandora DARS-AS1 li ser apoptosis lêkolîn kir.Wekî ku tê hêvî kirin, têkçûna DARS-AS1 bi girîngî perçebûna PARP-ê di hucreyên SW620 de zêde kir û rêjeya şaneyên annexin V-erênî di xetên hucreyên SW620, HCT116, HepG2, û MBA-MD-231 de zêde kir (Hêjî. 3k).3).3f–h), destnîşan dike ku bandora antî-apoptotîk a DARS-AS1 di hucreyên penceşêrê de berevajî fonksiyona PACT-ê-apoptozê ye.Bi hev re, ev encam destnîşan dikin ku mekanîzmaya fonksiyona onkojenî ya DARS-AS1 dibe ku bi astengkirina fonksiyona PACT-ê be.
Dûv re, me encamên fonksiyonel ên komeleya DARS-AS1-PACT lêkolîn kir.PACT hate ragihandin ku PKR bi têkiliya rasterast ve çalak dike, ku dûv re fosforîlasyona eIF2α zêde dike, dibe sedema jêbirina werger û apoptosis17.Pêşîn, me lêkolîn kir gelo DARS-AS1 bandorê li cîhkirina hucreyî ya PACT û PKR dike.Mîkroskopa floransê ya konfokal destnîşan kir ku PACT û PKR di şaneyên SW620 de bi hevrêzek pearson a navînî 0.72 pir bi colocalized bûn.Di vê navberê de, derbirîna DARS-AS1 bi girîngî hevderxistina PACT û PKR kêm kir (navgîniya hevrêziya Pearson 0.61) (Wêne 4a).Ji bo vekolînê ka DARS-AS1 dikare pêwendiya PACT-PKR modul bike, me di lîzên hucreya SW620 de ceribandinek hev-immunoprecipitation (co-IP) bi antî-PACT-ê re kir.PKR di şaneyên kontrolê de di antî-PACT de pir dewlemend bû, di heman demê de vejandina PKR di lîzatên ji şaneyên ku DARS-AS1 zêde îfade dikin bi girîngî kêm bû (Hêjî. 4b).PACT û PKR-ya binavkirî ya paqijkirî ji bo ceribandinên girêdana proteîna in vitro hatin bikar anîn.Li gorî vê yekê, yên ku DARS-AS1 peyda kirin lê RNA-ya kontrolê tune, danûstendina PACT-PKR-ya tepisandin nîşan dan (Wêne 4c).Hemî encaman destnîşan kir ku DARS-AS1 pêwendiya PACT û PKR hilweşand.
Hevcivînek PACT û PKR di hucreyên kontrolê de an şaneyên ku DARS-AS1 zêde îfade dikin de bi karanîna mîkroskopa fluorescence ya konfokal hate dîtin.Navok bi DAPIyê hatin rengkirin.Encamên îstatîstîkî ji 16 wêneyan hatin bidestxistin.b Hev-immunoprecipitation (co-IP) bi karanîna antî-PACT-ê di lîzên hucreyê yên hucreyên SW620 yên kontrolê de an jî şaneyên ku DARS-AS1 zêde îfade dikin.c PACT-ya binavkirî, PKR-ya paqijkirî û bi DARS-AS1 an RNA-ya xapînok ve di vitro de hate transkrîbe kirin ji bo analîza girêdana proteîna in vitro.Ji bo îmmunoprecipitation antîkorên dijî-ala hatin bikar anîn.d Immunoblots bi antîbodên destnîşankirî di şaneyên SW620 û HCT116 ên ku bi kontrolê shRNA an DARS-AS1-shRNA ve hatî veguheztin, li dûv birçîbûna serumê hatin kirin.e astên îfadeya DARS-AS1 hesasiyeta hucreyî ya ji thapsigargin re guhert.Hucreyên SW620 bi DARS-AS1 shRNA, DARS-AS1 plasmidê zêde îfadekirinê an plasmîdê kontrolê ve hatin veguheztin.Ji bo 48 saetan şaneyên bi thapsigargin hatin dermankirin û zindîbûna şaneyê bi reagenta MTS hate destnîşankirin.f In vitro DARS-AS1 an RNA-ya dummy transkrîbekirî û PACT-ya paqijkirî ji bo ceribandina aktîvkirina in vitro û tespîtkirina immunoblotê hate bikar anîn.g Immunoblots ku van antîbotan bikar tînin, li ser şaneyên SW620-ctrl (çep) an şaneyên ku mutantên PKR-ê zêde îfade dikin (rast) hatin kirin.Dûv re ev hucre bi shRNA-ya kontrolê an DARS-AS1-shRNA ve hatin veguheztin û dûv re birçîbûna serumê.h Flow cytometry destnîşan kir ku neçalakkirina PKR-ya mutant di şaneyên SW620 de apoptoza ku ji hêla DARS-AS1 ve hatî çêkirin telafî dike.immunoblots bi antîkorên destnîşankirî di şaneyên SW620 (çep) an HCT116 (rast) de hatin kirin.Hucreyên ku bi shRNA-ya kontrolê an DARS-AS1 shRNA ve têne veguheztin, ji serumê bêpar in û bi 100 nM PKR C16 înhîbîtor an DMSO têne tije kirin.Bara pîvanê = 5 μm.Daneyên ku têne xuyang kirin navînî ± veqetandina standard a sê ceribandinan in.* p ≤ 0,05 T-testa Xwendekarê du-deng.
Bi gelemperî tê bawer kirin ku gava PACT bi PKR17 re têkilî daynin, fosforîlasyona PKR li Thr451 dikare were çêkirin.Encamên me destnîşan kirin ku asta fosforîlasyona PKR piştî birçîbûna serumê di hucreyên têkbirinê yên DARS-AS1 de bi girîngî bilind bû (Hêjî. 4d û Hêjmara Pêvek. 4a).Li gorî vê yekê, me dît ku fosforîlasyona eIF2α, substrata sereke ya PKR, ji hêla DARS-AS1 shRNA ve jî bi girîngî hate zêdekirin (Hêjî. 4d û Hêjmara Pêvek. 4a).Thapsigargin stresek ER e ku dibe sedem ku ER Ca2+ berde.Hat ragihandin ku dermankirina bi thapsigargin re diyar û aktîvkirina PACT-ê çêdike, ku bêtir bi PKR-ê re têkilî û çalak dike, bi zêdekirina fosforîlasyona eIF2α 18,61 ve dibe sedema apoptozê.Li vir, me thapsigargin wekî stimulatorê rêça PACT/PKR bikar anî da ku vekolîn ka DARS-AS1 dikare alîkariya hucreyan bike ku bi astengkirina rêça PACT/PKR stresê derbas bikin.Me dît ku asta îfadeya DARS-AS1 bi berxwedana hucreyê ya bi thapsigargin re têkildar e.Hucreyên SW620 yên ku DARS-AS1 zêde îfade dikin, dema ku bi thapsigargin têne derman kirin çêtir dijîn, dema ku şaneyên bi têkbirina DARS-AS1 hesastir bûne (Hêjî. 4e).Li gorî van encaman, DARS-AS1 zêde îfadekirina fosforîlasyona PKR-ya ku bi thapsigargîn ve hatî çêkirin kêm kir (Hêjmara Pêvek. 4b).Berevajî vê, piştî tedawiya thapsigargin, PKR û eIF2α li gorî şaneyên kontrolê di şaneyên têkçûyî yên DARS-AS1 de bi rêjeyek bilindtir hatin fosforîlekirin (Hêjmara Pêvek. 4b).Balkêş e, thapsigargin bi rengekî-girêdayî dozê îfadeya DARS-AS1 vediguhezand, ku dibe ku fonksiyonek dij-stresê ya DARS-AS1 destnîşan bike (Hêjmara Pêvek. 4c).Wekî din, me ceribandinên aktîvkirina in vitro kir ku van çavdêriyan piştrast bikin.Bi kurtasî, PKR ji lîzên hucreyê bi karanîna antî-PKR-ê hate paqij kirin, dûv re bi PACT-ya rekombînant û DARS-AS1 ve hatî veguheztin in vitro hate înkubakirin.Piştî reaksiyona enzîmatîk, phospho-PKR bi karanîna WB ve hate tesbît kirin.Encamên me destnîşan kirin ku fosforîlasyona PKR ji hêla DARS-AS1 ve bi girîngî hate asteng kirin, lê ne ji hêla RNA-ya kontrolê ve (Wêne 4f).Van encamên in vitro û in vivo destnîşan dikin ku DARS-AS1 çalakkirina PKR-ya navbeynkariya PACT-ê asteng dike.Di heman demê de, me di hebûna DARS-AS1 de kêmbûnek di vegerandina PACT de jî dît (Wêne 4f).Ev encam bi encamên ceribandina girêdana proteîna in vitro re hevaheng e (Wêne 4c) û dîsa fonksiyona astengkirina DARS-AS1 ji bo komeleya PACT-PKR diyar dike.
Ser246 û Ser287 di qada D3 ya PACT de ji bo çalakkirina PKR di bin stresa hucreyî de hewce ne.Veguheztina du bermayiyên serine ji bo alanîn PACT mutant (mutD) da, ku di nebûna stresê de PKR çalak kir, û veguheztina alanîn (mutA) protokol berovajî kir.Ji ber ku me girîngiya vê domainê bi têkiliya rasterast bi DARS-AS1 re nîşan da, me van her du mutantên PACT-ê hilberandin da ku biceribînin ka gelo ev bermah jî dikarin bi DARS-AS1 re têkildar bin.Balkêş e, her du mutant şiyana girêdana bi DARS-AS1 (Hêveka Pêvek. 4d) winda kirin, û destnîşan dike ku dibe ku avahiyek bêkêmasî ya proteîna PACT ji bo têkiliyek bikêr bi DARS-AS1 re hewce be.
Wekî din, encamên me her weha destnîşan dikin ku astengkirina DARS-AS1-shRNA-ya ku ji ber pirbûna hucreyê ve hatî çêkirin dikare bi qismî bi eşkerekirina mutantek PACT-a neyînî ya serdest (PACTmutA) an mutantek PKR-ya negatîf a serdest (PKRmut) ve were vegerandin (Hêjmara Pêvek. 4e. e).Zêde îfadekirina mutantên PKR yên serdest-neyînî fosforîlasyona PKR ya ku ji hêla têkbirina DARS-AS1 ve hatî çêkirin û her weha fosforîlasyona eIF2α di hucreyên bêserûm de kêm kir (Wêne. 4g).Ya girîngtir, rêjeya hucreyên apoptotîk ên ku ji hêla DARS-AS1 veqetandî ve hatî çêkirin jî di şaneyên ku PKRmut zêde îfade dikin de kêm bû (Hêjî. 4h û Hêjîrê. 4g).Astengkirina çalakiya PKR kinase di heman demê de fonksiyona DARS-AS1 jî xera dike, ji ber ku encaman destnîşan kir ku têkçûna DARS-AS1 kêm caran fosforîlasyona PKR û eIF2α çêdike dema ku hucre bi înhîbîtorek PKR-taybetî C16 têne derman kirin (Wêne. 4i û Fig. 4h).).Bi hev re, encamên me destnîşan dikin ku DARS-AS1, bi kêmanî beşek, bi astengkirina çalakkirina PKR-ya navbeynkariya PACT-ê, pirbûna hucreyê pêşve dike.
Ji bo ku em rola DARS-AS1 di tumorîjenê de bêtir lêkolîn bikin, me ceribandinên di vivo de bi karanîna modelek xenograftê ya mişkî pêk anî. Encam nîşan didin ku têkbirina DARS-AS1 di mişkan de mezinbûna tumorê bi rengek berbiçav kêm kir (nirxa p <0,0001) (Hêjî. 5a). Encam nîşan didin ku têkbirina DARS-AS1 di mişkan de mezinbûna tumorê bi rengek berbiçav kêm kir (nirxa p <0,0001) (Hêjî. 5a). Rezulytatы xuya dike, ji bo DARS-AS1-ê nîşan dide ku ew qas kêm dibe (nirxa p <0,0001) (ris. 5a). Encam destnîşan dikin ku têkbirina DARS-AS1 bi tundî mezinbûna tumorê di mişkan de kêm dike (nirxa p <0.0001) (Wêne 5a).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0.0001）（图5a）结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0.0001）（图5a）。 Rezulytatы diyar kir, ku DARS-AS1 niqteya DARS-AS1 pir kêm dike (nirxa р <0,0001) (ris. 5a). Encaman destnîşan kir ku têkbirina DARS-AS1 bi girîngî mezinbûna tumorê di mişkan de kêm kir (nirxa p <0.0001) (Wêne 5a).Bi vî rengî, di koma têkçûn DARS-AS1 de, kêmbûnek girîng di navgîniya qebareya tumorê de bi qasî 72.9% û navînî girseya tumorê bi qasî 87.8% kêm bû (Wêne 5b-d).Van encaman bi tundî destnîşan dikin ku DARS-AS1 dikare bi girîngî mezinbûna tumor di vivo de pêşve bibe.
Bandorên têkbirina reklama DARS-AS1 li ser onkojeneza kolorektal di mişkên tazî de.Kevirên mezinbûnê (a), mezinahiya tumorê (b), giranî (c), û wêneyên tumor (d) têne xuyang kirin.Barên çewtiyê ±SEM nîşan dide. n = 10. ****p < 0.0001, bi testa t-ya Xwendekarê du-tewre. n = 10. ****p < 0.0001, bi testa t-ya Xwendekarê du-tewre. n = 10. ****p < 0,0001 li gor krîterê Stьyudenta. n = 10. ****p < 0.0001 T-testa xwendekaran a du dûvik.n = 10. ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验。 ****p < 0.0001，通过双尾学生t检验。 ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. ****p < 0.0001 T-testa xwendekaran a du dûvik.e Kaplan-Meier pêwendiya di navbera astên îfadeya DARS-AS1 û zindîbûna giştî de di nexweşên bi UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM, û LGG de analîz kir.Asta bilind a îfadeya DARS-AS1 di nexweşan de di 50% jorîn de bû;asta nizm ya îfadeya DARS-AS1 di nexweşan de di binê %50 de bû.P-nirx bi karanîna testa rêza têketinê hatine destnîşankirin.f Modela pêşniyarkirî ya ku tê de DARS-AS1 rêça PACT-PKR û mezinbûna tumorê bi rê ve dibe.
Ji bo ku em bandora klînîkî ya DARS-AS1 çêtir fam bikin, me têkiliya di navbera îfadeya wê û zindîbûna nexweş de lêkolîn kir.Bi analîzkirina daneya TCGA, me dît ku bilêvkirina DARS-AS1 ya bilind bi melanoma uveal (UVM), kromofobîya gurçikê (KICH), kansera hucreya papillary renal (KIRP), mesothelioma (MESO), multiplex ve girêdayî ye.Zindîbûna kêmtir bi morfoza glioblastoma (GBM) û nexweşên bi glioma mêjî ya pola nizm (LGG) re têkildar bû (Wêne 5e).Van encaman destnîşan dikin ku DARS-AS1 dibe ku di pêşkeftina tumora klînîkî de rolek girîng bilîze û dibe ku di pir kanserên pirjimar de biyomarkerek pêşbînîker be.
Di vê lêkolînê de, bi karanîna pîvandina fonksiyonê ya CRISPRi-ya mezin, me destnîşan kir ku DARS-AS1 lncRNA stresa hucreya penceşêrê bi rêkûpêkkirina du bersivkerên stresê yên sereke, PACT û PKR, derbas dike.Bi têkiliya rasterast bi PACT-ê re, DARS-AS1 çalakkirina PKR-ya navbeynkariya PACT-ê asteng kir, bi vî rengî pêşî li mirina hucreya apoptotîk digire û pirbûna hucreyê pêşve dike (Wêne. 5f).Rêzkirina DARS-AS1 di gelek celebên penceşêrê de hate dîtin, û destnîşan dike ku fonksiyona wê ya pêşvebirina zindîbûna hucreya penceşêrê di bin şert û mercên stresê de dibe ku bi berfirehî ji gelek celebên penceşêrê re were sepandin.
PACT wekî proteînek aktîvatorê PKR-ê hate nas kirin, û aktîvkirina PKR-ya navbeynkar a PACT di bersivên stresê de bi rêkûpêkkirina transkripsiyonê, werger, apoptosis û pêvajoyên din ên girîng ên hucreyî de rolek girîng dilîze.Bi dehsalan, hewildan hatine kirin ku rêziknameya taybetî ya penceşêrê ya kaskada PACT-PKR were fam kirin.Li vir, lêkolîna me mekanîzmayek cûda ya rêziknameya PACT-PKR di hucreyên kanserê de bi riya lncRNA DARS-AS1 ya hucreyî, ku rasterast bi PACT-ê ve girêdide, danûstendina PACT-PKR asteng dike, çalakkirina PKR-ê û fosforîlasyona eIF2α asteng dike, bi vî rengî apoptoza ku ji stresê ve hatî çêkirin asteng dike û teşwîqkirina belavbûna kanserê ya dawî.hucreyan.Ev vedîtin ronahiyê dide armancên lncRNA yên potansiyel ên ji bo pêşgotin û dermankirina penceşêrê.
Daneyên me destnîşan kir ku têkbirina DARS-AS1 hucreyan ji birçîbûna serumê re bi zêdebûnek girîng a PKR û eIF2α fosforylated hîs dike.Van encaman destnîşan dikin ku DARS-AS1 bi astengkirina çalakiya PACT/PKR di bin şert û mercên dijwar de zindîbûna hucreya penceşêrê pêşve dike.Gelek RNAyên din ên ne-kodkirî, wek ASPACT û nc886, di heman demê de bi kêmkirina PACT48 mRNA an bi rêkûpêkkirina otofosforîlasyonê bi girêdana bi PKR49,50,64 ve, di eksê PACT/PKR de jî beşdar in.Di nav wan de, DARS-AS1 wekî astengkerê komeleya PACT-PKR tevdigere.Vê lêkolînê têgihiştina me ya rêziknameya eksê PACT/PKR û rola lncRNAs di bersivên stresê de dewlemend dike.
PACT sê domên cuda hene.Her du dsRBD-yên yekem bes e ku bigihîjin girêdana pêwendiya bilind a PACT bi PKR re, dema ku qada sêyemîn (D3) ji bo aktîvkirina PKR in vitro û in vivo hewce ye.Lêkolîna me destnîşan kir ku DARS-AS1 bi bijartî bi domaina D3 re têkilî dike (Wêne. 3h).Ji ber mezinahiya lncRNA (768 nukleotîd), girêdana DARS-AS1 bi D3 re dikare bi fizîkî têkiliya di navbera qada PACT ya dsRBD û PKR de asteng bike, bi vî rengî têkiliya PACT û PKR asteng bike.Mutasyonên xala PACT-ê yên ku Ser246 û Ser287 di D3 de bi alanîn an aspartate veguherandine girêdana wê ya girêdanê ya ji bo DARS-AS1, îşaret bi girîngiya taybetmendiyên giştî yên avahî û elektrîkî yên D3-ê di têkiliya wan de dike.Zêdetir hûrguliyên vê mekanîzmayê dê di pêşerojê de hewce bibin, bi karanîna analîzên biyokîmyayî yên rasttir û analîza avahîsaziya PACT-ê ya rezîliya bilind.
Lêkolînên berê ragihandine ku DARS-AS1 bi çend mekanîzmayên 51,52,53 belavbûna hucreyê pêşve dike.Di mînakek de, vekoleran dît ku DARS-AS1 gena DARS-a ku proteîna xwe ya antisense kod dike bi armanckirina miP-194-5p di hucreyên kansera gurçikê de verast kir.Lêbelê, di lêkolîna heyî de, têkbirina DARS-AS1 bandorek hindik li ser veguheztina DARS di gelek celebên penceşêrê de, di nav de bi kêmî ve kansera kolorektal, pêsîrê, û kezebê heye.Ji ber ku lncRNAs qalibên îfadeya hucre û tevn-taybetî nîşan didin, dibe ku mekanîzmayên fonksiyonel li seranserê cûreyên penceşêrê neyên parastin, ku dibe ku beşdarî vê cûdahiya di navbera çavdêriyên me û nirxandinên berê yên kanserên cûda de bibe.Lêkolînên taybetî hewce ne ku mekanîzmayên taybetî yên pêvajoyên cûda yên fîzyolojîk û patholojîkî zelal bikin.
Analîzek daneyên klînîkî destnîşan kir ku îfadeya DARS-AS1 di tumoran de bi zindîbûna nexweşên penceşêrê re berevajî ve girêdayî ye, ku ev yek girîngiya DARS-AS1 / PACT / PKR di pêşbîniya penceşêrê de destnîşan dike.Di encamê de, lêkolîna me destnîşan dike ku DARS-AS1 rêgezek eksê nîşana PACT/PKR-ê ye, pirbûna hucreyên penceşêrê pêşve dike, û di dema bersiva stresê de apoptozê asteng dike, ku rêzek din a lêkolînê peyda dike û ji bo lêkolîna pêşerojê li ser dermankirinên potansiyel balkêş e. .
Rêzên hucreyên mirovî SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 û HEK293T ji Binesaziya Çavkaniya Xeta Hucreya Neteweyî ya li Chinaînê hatine wergirtin.Hemî hucre di navgîniya DMEM (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) de ku bi 10% FBS (Gemini, Brooklyn, NY) û 1% penîsîlîn-streptomycin (Thermo Fisher Scientific) li 37 °C, 5% CO2 hatî tije kirin, hatin parastin.inkubator.
Anti-PACT, Abcam (ab31967);Anti-PKR, Abcam (ab184257);Anti-PKR (phospho-T451), Abcam (ab81303);Anti-Flag, Abcam (ab125243);Anti-eIF2α, Abcam (A0764));antî-eIF2α (fosfor S51), Abcam (ab32157);antî-PACT (fosfor S246), Abgent (AP7744b);antî-β-tubulîn, CST (2128);Mişkê normal IgG, CST (5415S);Kîroşka normal IgG, CST (2729S).Di PBST de ji bo Western blottingê 1:1000 û ji bo IP-yê 1:100 antîbodî hatin rijandin.
sgRNA bi karanîna amûrek gelemperî ya bi navê CRISPR-ERA66 hate pêşve xistin.Me ji bo pêşkeftina sgRNA pîvanên amûra xwerû bikar anî û algorîtmaya ku malperên girêdana sgRNA li herêma 3 kb hesab kir.navenda wê TSS ye.Komên olîgonukleotîdên sgRNA li CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) hatin sentez kirin û di nav plasmîdên pgRNA yên însanî de klon kirin (Addgene #44248).Bi tevahî 12 μg ji plasmîdeya pgRNA ya mirovîkirî ya hevgirtî, 7,2 μg psPAX2 (Addgene #12260), û 4,8 μg pMD2.G (Addgene #12259) di nav 5 x 106 HEK293T de bi karanîna veguheztina DNA-ya 10 cm ve hatî veguheztin. hucreyên (CWBIO, Pekîn, Çîn) li gorî rêwerzên çêker.Spernatantên ku vîrus tê de hene 48 û 72 saetan piştî veguheztinê hatin berhev kirin û di parzûnek 0,45 μm de hatin parzûn kirin.Ji bo vekolînê, hucreyên SW620 ku proteîna hevberdanê dCas9/KRAB îfade dikin bi veguheztina vîrusê ve hatin wergirtin.Hucreyên SW620 yên guhertî bi pirtûkxaneya vîrusê ve di çar ceribandinên enfeksiyonê yên serbixwe de li MOI-ya 0.1-0.3 vegirtî bûn û 2 rojan bi 2 μg / ml puromycin (Sigma, St. Louis, MO) hatin nimûne.Dûv re, hucre ji bo 18 rojan in vitro bi vegirtina pirtûkxaneyê ya herî kêm 500 hucre/sgRNA ji bo vekolînê hatin çandin.
ADNya Genomîk li gorî rêwerzên QIAamp DNA Blood Midi Kit (QIAGEN, Düsseldorf, Almanya; 51183) hate derxistin.Bi tevahî, 100 μg DNA-ya genomîk ji bo dubarekirina biyolojîkî ji bo avakirina pirtûkxaneyê hate bikar anîn.Herêma sgRNA bi du tûrên PCR-ê hate zêdekirin û bi barkodê ve hate girêdan.
Berhemên PCR bi karanîna NucleoSpin® gel û kîtê paqijkirina PCR (MACHEREY-NAGEL, Düren, Almanya; 740609.250) hatin paqij kirin û bi karanîna kîta tespîtkirina DNA-ya dubendî ya Qubit™ HS (Thermo Fisher Scientific; Q32854).
Testa MTS ji bo pîvandina pirbûna hucreyê hate bikar anîn.Şane di lewheyên 96-kaniyê de bi dendika destpêkê ya 2000 şan/kanî hatin çandin.Hejmara têkildar a hucreyan rojane di dema destnîşankirî de bi tevahî 4-6 rojan hate pîvandin.Ji bo her bîrekê, 20 μl reagenta MTS (Promega) bi 100 μl DMEM re hate rijandin, 4 demjimêran li 37 ° C bi hucreyan re hate înkubakirin, û dûv re OD490 hate pîvandin.
Kapasîteya mezinbûna bêserûber bi analîzkirina pêkhatina qadan hate kifş kirin.Bi kurtasî, 2000 hucreyên ku bi shRNA DARS-AS1 an shRNAya kontrolê veguherîbûn di mîkroplateyên girêdana pir kêm (Corning) de bi guherîna navîn her 4 rojan hatin çandin.Sferoîd piştî 14 rojan hatin jimartin.500 şaneyên ku bi DARS-AS1 plasmidê zêde îfadekirinê an plasmîdek kontrolê ve hatî veguheztin ji bo ceribandina zêdekirinê hatine bikar anîn, wekî din rêbaz neguherî bû.
RNA li gorî rêwerzên Pergalên Hevbeş ên Riboprobe® (Promega P1440) bi karanîna T7 RNA polymerase û biotin-16-UTP (Roche 1138908910) hate veguheztin.Destpêkên ku li vir têne bikar anîn di Tabloya Pêvek 4 de têne navnîş kirin.
Herêmên PACT an PKR-kodkirina proteînê li pET15b (Addgene #73619) hatin klon kirin û veguherî BL21 (DE3).Bakterî di şevekê de li LB-ya ku bi ampicillin hatî peyda kirin hatin inkubasyon kirin û dûv re 100 qat bi LB-ya nû ve hatin rijandin.Dema ku OD600 ya navîn gihîşt 0.8, 1 mM IPTG hate zêdekirin da ku îfadeya proteîn bike.Piştî înkubasyonê bi şev bi hejandina nerm (250 rpm li 20°C), peleta şaneyê bi santrîfugasyonê (4000 rpm, 10 min, 4°C) hate berhev kirin.Pelê hucreyê di tampon lîzê de (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) ji nû ve suspend bikin û 30 hûrdem li ser cemedê bihêlin, dûv re sonik bikin (15 hûrdem, 5 s on/off, li ser berfê) û santrîfuj bikin (13,000 rpm)., 30 min, 4°С).Dûv re supernatant 3 caran di 4°C de li rezîna Ni-NTA (QIAGEN) hate barkirin, 4 caran bi tamponê şuştinê (50 mM Tris, pH 8.0, 40 mM imidazole, 250 mM NaCl) hate şûştin û 3 caran bi tevahî hate şuştin. ji 10 ml tampon eluent (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 300 mM imidazole).Proteîna paqijkirî bi karanîna WB-ê hate destnîşankirin û hûrbûn bi karanîna kîtê proteîna Qubit™ hate destnîşankirin (Thermo Fisher Scientific; Q 33212).
Vekolînên RIP-ê wekî ku berê hatî destnîşan kirin, bi guhertinan ve hatin kirin.Bi kurtî, 1x tampon RIP (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,5% NP-40, înhîbîtorê RNasin ribonuklease (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 mM DDM, protease) lyses71 xcyto (Roche, 1 mM DTT) û di 13,000 rpm de 15 deqîqeyan li 4 °C santrîfuj bikin.Dûv re supernatant bi proteînên magnetîkî yên A + G (Millipore) ku bi 5 μg antî-PACT (Abeam) an IgG (CST) ve girêdayî ye, hate înkubakirin.Kulîlk 5 caran bi tampon 5x RIP hatin şûştin, dûv re bi proteînaza K (NEB) hatin şûştin.RNA bi Trizol hat derxistin û ji hêla RT-qPCR ve hat destnîşankirin.Primer di Tabloya Pêvek 5 de têne pêşkêş kirin.
Vekolîna RIP ya in vitro li gorî protokolek standard a RIP-ê ya guhertî hate kirin.Bi tevahî 5 pmol RNA-ya in vitro transkrîbekirî 1x bi tampon RIP-ê hate rijandin û bi înkubasyonê li 65 °C 5 hûrdeman hate rijandin û pişt re hêdî hêdî sarbûn heya germahiya odeyê.Bi tevahî 5 pmol proteînên PACT-ê yên ala-labelkirî yên saxlem an mutated ji E. coli hatin paqij kirin.Bi RNA-ya vejenkirî 2 saetan li 4°C înkub bikin û ji bo analîza RIP-ê ji bo IP-a dijî-ala prosedûra jorîn bişopînin.
Ji bo analîzkirina dirêjkirina RNA, hucreyên 1 × 107 bi tampon 1xRIP hatin lîzkirin.Piştî santrîfujasyonê di 13,000 rpm de ji bo 15 hûrdeman li 4 ° C, supernatant bi 30 μl mûçikên magnetîkî yên streptavidin (Beckman) ji bo 2 demjimêran li 4 ° C pêşî hate derman kirin.Dûv re lîzata safîkirî bi tRNAya hevîrtirşkê hate peyda kirin û bi 40 pmol RNA vejenkirî bi şev li 4 °C hate înkubakirin, dûv re 2 demjimêrên din û 20 μl mêşên magnetîkî yên nû yên streptavîdîn ên ku bi BSA re hatine asteng kirin lê zêde kirin.Pêngava şuştinê 4 caran bi tampon 5x RIP û 4 caran bi tampon 1x RIP pêk tê.Proteînên têkildar bi tamponê helandina biotin (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 12.5 mM D-biotin, PMSF) hatin şuştin û li ser NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen) hatin veqetandin.Piştî rengkirina zîv (Beyotime Biotechnology), hin band ji hêla MS ve hatin derxistin û analîz kirin.
Ji bo ceribandina têkiliya di navbera PACT û PKR de analîzek Co-IP hate kirin.Bi kurtasî, lîzên supernatant bi înkubakirina 1 x 107 şaneyên lîzkirî di 1 x tampon RIP de hatin amadekirin û dûv re santrîfugasyon di 13,000 rpm de ji bo 15 hûrdeman li 4 °C.Lîzat bi proteîna A + G mûçikên magnetîkî ve hatin barkirin, bi 5 μg antî-PACT-ê ve hatin girêdan, û bi nermî bi şev di 4 °C de zivirî.Kulîlk 3 caran bi tampon 5×RIP, du caran bi tampon 1×RIP hatin şûştin û bi tampon 1×SDS hatin şuştin.Proteîna hatî vegerandin bi gêla SDS-PAGE ve hate analîz kirin û ji hêla WB ve hate tespît kirin.
Du pmol PACT ala û 1 pmol PKR ji E. coli hatin paqijkirin.Di tamponek 1× RIP de were rijandin û bi 10 pmol RNA vejenkirî 2 saetan li 4 °C înkube bikin.Dûv re, ew bi proteîna A + G antî-lebelkirî ya bi berika magnetîkî ya hevgirtî du demjimêrên din ve hatin inkubasyon kirin.Dûv re mişk çar caran bi tampon 1x RIP hatin şuştin û bi 1x tampon SDS hatin şuştin.Encamên PACT û PKR ji hêla WB ve hatin tesbît kirin.
Dema şandinê: Sep-23-2022
